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黄原胶的制备

发布日期:2014-09-30 11:53:14
黄原胶的制备研究
黄原胶的制备
黄原胶的制备,1952年美国农业部依利诺斯州皮奥里 尔北部研究所分离到一株甘蓝黑腐病黄 单胞菌(Xanthowonos campestris )能使甘蓝 提取物转化为水溶性的酸性胞外杂多糖,由 于该多糖有很高的粘度、流动触变性、稳定的 理化性质,且无毒,故具有广阔的市场前景和 诱人的经济效益,产业界和学术界对其作了 大量的生化、工程、工艺和产品开发方面的研 究,70年代国外开发成功了较成熟的黄原胶 生产工艺。目前美、英、法、日、德等国均大量 生产黄原胶,形成50余种产品规格,广泛应 用于钻井、采油、食品、医药等20多个行业, 产量己近3万t,价格约为1. 4万美金/t。
国内对黄原胶的研究始于1979年,中科 院微生物所和南开大学[2]在4 m3的发酵罐 中采用玉米淀粉作原料得到了黄原胶,目前 己有十几家企业生产黄原胶。总体上说,国 内的研究主要集中在生物化学和产品后处理 方面,而对发酵动力学、工程、工艺和产品规 格方面的研究较少。
1黄原胶的生物化学
Sutherland^]等发现黄原胶的生物合成 机制不同于蛋白质、核酸等生物大分子,其合 成不需要模板,属于非模板合成,在16种酶 的作用下分别以糖-核苷酸和C55-Lipid-p糖 基载体脂作为一级和二级糖基载体经过核 苷酸的形成、五糖重复单元的形成、五糖重复 单元在胞外聚合成黄原胶胞外多糖3个阶 段。
1 1菌种和培养基
己发现甘蓝黑腐病黄单胞菌,锦葵黄单 胞菌,胡萝卜黄单胞菌,木薯萎矮病黄单胞菌 等菌种均能产生黄原胶,但目前仍多以甘蓝 黑腐病黄单胞菌及其变异株为产生菌。 Sutherland3]认为,筛选细胞壁合成缺陷等菌 株可能获得黄原胶高产菌,高产菌需冷冻干 燥或无营养液保存。
黄单胞杆菌产生黄原胶常用的培养 # 7是:以葡萄糖、蔗糖或淀粉等为碳源,以 蛋白质、鱼粉、豆粉或硝酸盐为氮源,加 KH2PO4、MgSO4、CaCO3 等无机盐和 Fe2^、 Mn2+、Zn2+等微量元素,以及生成促进剂谷 氨酸、柠檬酸、延胡素酸等。
1986年赵大健等[4]从甘蓝黑腐病斑中 分离出甘蓝黑腐病黄单胞菌N. K-01,经培 养后,分别接种到摇瓶和发酵罐中发酵,黄原 胶产量可分别达28 ~ 30g/ L和22. 4g/ L,淀 粉的转化率分别是70%和55%。N.K-01菌 利用玉米淀粉作碳源产生黄原胶的能力高于 葡萄糖,且连续10代未出现小菌落而使发酵 能力降低,这与Candmus[5]的报道有2方面 不同:(1) NRRL B-1459甘蓝黑腐病黄单胞 菌在长期传代后会蜕变为小菌落,使黄原胶 
 
的产量和丙酮酸的含量均大大降低;谷氨酸 等生成促进剂对N. K-01菌无促进作用,而 对NRRL B-1459菌有促进作用;此外用常规 的紫外线或其它化学诱变处理往往得不到高 产菌株,反而容易形成失去胶荚膜的粗造型 菌落。
江伯英用野油菜黄单胞菌接种在4% 的淀粉培养基中,15h后能使淀粉完全液化,
发酵48h能产生23 ~ 29g/ L黄原胶。
鉴于采用淀粉为底物的黄原胶发酵液在 用低级醇提取时会发生剩余淀粉和黄原胶同 时沉淀的现象,影响产品的质量,刘秀芳 等1从萝卜的黑色病斑中分离出了一种L4 菌株,其最佳的碳源是蔗糖、黄原胶产量 21. 23g/L、发酵液粘度高达6.547Pa°s;在最 佳的发酵条件下,黄原胶产量可达28g/L以 上、发酵液粘度高达14~16Pa、[8]。王修垣 等^在2t中试罐上研究了 L4菌株的发酵工 艺,将L4菌种经培养后按5 %的接种量转入 2 t发酵罐,装料1. 3 t,搅拌转速为180 r/min,发酵72h,所得发酵液的粘度在8Pa°s 以上、最高达12 Pa、底物的平均转化率是 62 45%。后来11q在20 t的工业罐中,以蔗 糖为底物,装料10 ~ 15 t,搅拌转速为160 r/min,发酵液的粘度为7 ~ 9. 5 Pa °s,多糖对 底物的平均转化率是61. 6%。
刁虎欣等[11_ 12]考察了影响野油菜黄单 胞菌的发酵因素,发现碳源和无机盐是影响 黄原胶分子质量大小的最显著因素,最佳的 碳源是蔗糖和玉米淀粉的混合物,最佳的无 机盐是轻质碳酸轉,它可作为缓冲剂,调节发 酵过程的pH,其解离出的Ca2+可作为聚合 酶的促进因子,提高聚合酶的活性,提高黄原 胶的聚合度和分子质量。丙酮酸含量是黄原 胶产品的一项重要的指标,碳源、氮源和摇瓶 振荡速度是影响黄原胶丙酮酸含量的极显著 因素。
李卫旗等[13]将甘蓝黑腐病黄单胞菌 XC-82. 5进行了改良,获得了诱变株R5,用 蔗糖作碳源时黄原胶的产量是31.35g/L、发血 酵液粘度是21 Pa。s发酵周期可缩短至64 h最佳的无机盐是碳酸钙,用菜油取代PPE 作为消泡剂可使摇瓶染菌率从90%降为
8%。
由于采用菌体发酵时存在发酵后期因高 粘而造成供氧不足的困难,许喜林等[14]研究 了采用两步法发酵合成黄原胶的方法,第1 步是利用黄单胞菌发酵采用了较小量的碳 源及低的碳氮比,终止时间控制在25 h此时 可获得较大的生物量及胞外酶,而不生成黄 原胶,以有利于胞外酶的分泌和菌体的分离;
第2步胞外酶发酵采用了无氮培养条件,且 因发酵液中不含菌体省去了稀释和分离菌体 的工序,可降低生产成本,黄原胶的产率高于 单纯菌体发酵。
Pinches等[15以第2代大菌落NRRL BL1459 S4-LII为菌种,培养基中除了碳源、 氮源外,还加入了许多盐类(磷酸二氢钾、硫 酸钾、硫酸镁、氯化钙、柠檬酸、氯化铁)和微 量元素(如硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、钼酸钠、 碘化钾、硼酸)以更有利于黄原胶的产量和 质量;分别以L-谷氨酸、蛋白胨为氮源,发现 L-谷氨酸作氮源时发酵后期容易出现供氧 不足、氮源耗尽的问题,而蛋白胨作氮源时不 会出现这种现象;此外还发现一般情况下黄 原胶的发酵过程由氮源控制。
Peters 等:261 将 N RRL BL1459 S4-LII 经 培养后、接种发酵合成黄原胶,培养基中也加 入了多种盐类和微量元素,发酵过程中靠自 动滴加4%的盐酸或10%的氢氧化钠来保持 pH=7. 0。
Suh等m研究发现采用葡萄糖作碳 源,氯化铵作氮源(加入量分别是50g/L和2 g/L)其它条件同Peters等[26]时,发酵过程 由氮源控制。
可以看出,国内的研究集中在菌种和发 酵方法上,而国外则对影响黄原胶产量、质量 和效益的氮源、盐类、微量元素等因素作了大 量的研究,优化了生产工艺、提高了产品质。
1 2分子结构
1975年Jansson等[18]发现黄原胶的主 链由两个D-葡萄糖分子经(1—4)核苷键 连接构成线性的纤维素结构,主链上的每个 D-葡萄糖分子有一条“由两个D-甘露糖分 子和一个葡萄糖醛酸分子组成”的侧链,有的 侧链还有乙酸和丙酮酸,由于侧链含有酸性 基团,因此黄原胶在水溶液中呈现多聚阴离 子特性。黄原胶分子的带电荷侧链反向缠绕 纤维素主链,形成类似棒状的1级钢性结 树19];黄原胶分子间靠氢键形成双股的2级 螺旋立体结构[20];双股螺旋结构间靠微弱的 非共价键结合,排列成整齐的“超级接合带 状’的3级螺旋聚合结构[21];在极稀《 1%) 的水溶液中,不加热时黄原胶呈现典型的四 级菊花状聚集结构[12]。
王德润等[22]用透射电镜研究了单个黄 原胶分子形貌,用扫描电镜研究了温度、超声 波和浓度等因素对黄原胶分子形貌的影响, 证明黄原胶分子由40余个亚基组成了右手 双螺旋结构。他们用GPC方法[3研究了在 水溶液中黄原胶的构象,发现黄原胶在水溶 液中多以缔合态存在、少量以单分子态存在, 在缔合态和分子态之间存在动态平衡,缔合 态为多分子分段两两缔合呈右旋双螺旋构 象。赵大健等[4]采用纸层分析证明N. K-01 黄原胶含葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、丙酮 酸和乙酸5种组分,用气相色谱法证明N. K- 01黄原胶多糖由葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛 酸3种单糖组成,N. K-01黄原胶的红外谱 分析图谱与美国黄原胶红外分析图谱相同, 证明它们有相同的化学组成,用电泳分析发 现N. K-01黄原胶不含蛋白质,用特性粘度 法算得N. K-01黄原胶的相对分子质量是 241000。王德润等[22根据透射电镜的研究 结果,计算出黄原胶的相对分子质量是6X 106~25X 106,用光散射法^3]测定的黄原胶 是 2 36X 106。
2黄原胶的发酵动力学和发酵工程
发表的资料较少,且多为实验室的动力学研 究,国内的研究很少。
黄原胶发酵工艺多为间歇式,1972年 Silan等[24]研究了连续发酵工艺,发现黄原 胶的得率是稀释速率的函数,当稀释速率是 0. 15h^时,黄原胶的最高得率是0. 84g/h/ kg葡萄糖的转化率由间歇发酵时的60%提 高到连续发酵时的80 %以上。
赵大健等[4]在0. 2m3的2级种子培养 罐和1. 2m3的中试发酵罐中,采用两层6直 叶圆盘涡轮搅拌,4块标准挡板,单管通气。 可通过加大搅拌桨直径和搅拌转速,来提高 溶氧速度。
Galindo等[25研究表明,在低浓度和中 等浓度的黄原胶液中,通气时的搅拌功耗下 降较小,气含率较高,而在高浓度的黄原胶液 (0.35g/L)中,通气功耗下降很多、且有严重 的不稳定现象。
Zhao等:1q在中试规模的黄原胶发酵罐 中,用大直径的rushton桨取代小桨,结合转 速的控制,使功耗及发酵周期大幅度下降,传 热系数増加一倍以上。
Pinches等:15]在发酵罐中采用3层6直 叶圆盘涡轮搅拌,黄原胶的制备,用NRRL BL1459 S4-L II 为菌种的黄原胶发酵中对生物量、黄原胶浓 度、葡萄糖浓度和溶氧浓度分别建立了数学 模型,并进行了发酵过程模拟。
?:这方面国外进行了充分的研究,但公开血等別在19 m3的发酵罐中分别
Peters等別在发酵罐中采用3层inter- mig桨搅拌,当通入空气时由于发酵后期发 酵液粘度很大,若转速低于6.67s 1会发生 供氧不足的现象,降低了黄原胶的产量和分 子量;若保持总气量不变、通入部分纯氧,则 供氧能力明显増加,黄原胶的浓度也増加(即 使转速很低),因此供氧量(尤其发酵后期)是 影响黄原胶产量和质量的重要因素,可从工 艺和工程两方面克服供氧不足的问题。此外 电镜分析发现在罐中发酵情况与摇瓶发酵不 完全相同,带搅拌的罐中发酵时菌体表面不 存在粘液层。 
采用4层直叶圆盘涡轮、4层Ecato企业的 prochem maxflo Ts型揽拌奖或3层A315奖 进行搅拌,发现采用直叶圆盘涡轮时混合最 差,通气后搅拌效率最低。
Kawase等28]研究了搅拌釜内黄原胶发 酵液中混合时间,发现由于粘度的増加使混 合时间増加很大,且气体分散也影响了液相 混合,并提出了混合时间的模型。
此外,Pons等f 29]在鼓泡塔中研究了黄 原胶的发酵过程及模型化问题,发现同样功 耗时鼓泡塔中氧的混合和传递情况比搅拌釜 中好得多;采用Pinches等[15]的微分方程数 学模型,对发酵过程进行了模拟,与实验结果 吻合较好。Suh # M研究了鼓泡塔和气升 式反应器中黄原胶的发酵过程,发现气升式 反应器中氧传递速率满足不了菌体生长的要 求,导致黄原胶的生产速率较低,发酵周期很 长。由于黄原胶发酵后期粘度很大,加上发 酵液是有屈服应力的假塑性流体,使发酵罐 中溶氧、混合和传递很困难,需要很高的能 耗,而对鼓泡塔的研究发现,同一横截面上可 达瞬间混合均匀,因此利用鼓泡塔进行黄原 胶发酵有很大的优势。他们利用发酵罐中黄 原胶发酵的数学模型对发酵过程进行了模 拟,结果与实验值吻合较好。
3黄原胶的后处理
由于黄原胶发酵液具有较高的粘度使后 处理非常困难,其中菌体细胞的去除是提取 工艺的一大障碍。
3. 1预处理
该工序主要去除菌体细胞和各种不溶性 杂质,使黄原胶中不再含活性的菌体细胞、影 响产品质量的不溶性杂质和色素等。由于黄 原胶发酵液的粘度很高,因此各种后处理方 法均需将原始发酵液稀释至0. ~0. 5Pa、
以利于菌体细胞和杂质的去除以及黄原胶的 沉淀。
(1)离心法[18]。采用高速离心机,在 16,67s-1下30min可去除菌体细胞和不溶 性杂质。
(2 )过滤法。将发酵液加热至 120 °C,用〇. 45 ~ 1. 2um的微孔滤膜过滤,或 用硅藻土吸附的方法进行过滤,或用NaCl 溶液将黄原胶液进行适当的稀释,在95 °C下 搅拌2h,然后加入体积分数为2X 1(T6 ~ 2 5X 10^4的K2SO4凝结剂,再在95 °C下搅 拌2h,最后在75°C下过滤。
(3)酶降解法29]。将黄原胶发酵液,加 入体积分数为3X 10-4的碱性蛋白酶(如枯 草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌 和短小芽孢杆菌产生的酶),用1mol/L的 NaOH调pH至9. 0,在30°C下保存4h,然后 加入1 mol/L的NaOH使pH升至12 0,再 在30 °C下保存3h。该法只去除菌体细胞。
(4)次氯酸盐氧化法18]。将发酵液加 入体积分数为20%的含6%的次氯酸钠溶液 漂白剂,用NaOH将pH调至11. 5,搅拌反应 2 5h,再用HCl将pH调至5. 7。
(5)过滤-超滤浓缩法。李时岩等[31]用 硅藻土过滤可除去发酵液中大部分的菌体细 胞,用中空纤维内压超滤法对黄原胶进行提 纯和浓缩,可除去发酵液中悬浮的不溶性固 体、可溶性离子物质和大部分色素,将黄原胶 浓度从2 5%提高到8. 7 %。
3. 2沉淀法
()低级醇沉淀法^9]。常用的低级醇 有甲醇、乙醇、异丙醇等。在沉淀过程中加入 终浓度为0. 2% ~ 1%的一价盐如KCl或 NaCl时,由于一价阳离子可与黄原胶侧链的 聚阴离子结合,消除黄原胶分子表面的电荷, 促进它在醇溶液中的沉淀,可降低醇的用量。 主要的工艺流程如图1所示。
(2)钙盐-工业乙醇沉淀法t18]。黄原胶的制备,在黄原 胶发酵液中加入终质量分数为1. 5%的钙盐 (如Ca(OH )2和CaCl2),充分混合后,逐步加 入终质量分数为0. 8%的NaOH,再搅拌30 min,可形成黄原胶钙盐复合沉淀物;将沉淀 物压榨脱水、并充分打碎块状物,加入终体积 分数为50 %的工业乙醇,用HCl调pH至
 
图1低级醇沉淀法工艺流程
1. 5 ~ 2 0,搅拌30min,经过滤或离心可得到
黄原胶的沉淀物;在该沉淀物中再加入30% 体积分数的工业乙醇,用NH4OH调pH至中 性,经过滤或离心、烘干、粉碎和过筛可得到 黄原胶的产品。
(3)铝盐-异丙醇沉淀法。流程基本与 钙盐-工业乙醇沉淀法相同,但最佳的低级醇 是异丙醇,所用的铝盐有AlCb、AlAc3和 Al(NO3)3 等。
(4)季铵盐-甲醇沉淀法[30。十六烷基 三甲基氯化铵或溴化铵(QAC)能与黄原胶 生成QAC-黄原胶复合沉淀物,再用含0. 2% KCl的甲醇溶液洗去QAC,再经过滤、烘干、 粉碎和过筛可得黄原胶产品。
4黄原胶的性能和应用
4.1黄原胶的性能[315 19]
黄原胶的多级分子结构使其具有多种如 下优异的特性。
()黄原胶液即使浓度很低也具有很高 的粘度,如0. 1%的黄原胶水溶液的粘度约 为 1 Pa°s
(2)黄原胶的溶液粘度耐酸碱抗生物 酶降解;
(3)黄原胶的溶液粘度抗盐,此外当黄 原胶的浓度大于0.35%时,加入0. 01% ~ 1 %的一价金属盐可使其粘度増加;
(4)黄原胶溶液具有良好的假塑性;
()黄原胶溶液具有很好的悬浮能力和 乳化能力;
(6)黄原胶溶液在一4 ~ 93 °C范围内反
4 2黄原胶的应用[1832~35]
()在能源开发、地质矿产部门的应用。 低浓度的黄原胶水溶液就可保持水基钻井液 的粘度、使钻井液有好的悬浮性能,这可防止 井壁坍塌、抑制地层井喷、便于将切削下的碎 石排出井外,其性能远好于聚丙烯酰胺;黄原 胶的假塑性使处于钻头附近的黄原胶液由于 高速旋转引起的强剪切而表现出极低的粘 度,具有低磨阻特性,有利于节省能耗;由于 黄原胶的抗盐性、耐高温性等,使在海洋、海 滩、高卤层以及水冻土层等区域的钻井作业 中采用黄原胶液作为泥浆増稠剂时可节省长 途输送淡水的费用;黄原胶的制备,黄原胶液用于3次采油 的流变控制液可提高10%以上的采收率。 目前国外约有30% ~40%的黄原胶用于钻 井泥浆和3次采油。
复加热..冷冻.其粘度基本不变。()在其它行业的应用。黄原胶的应用
(2)在食品工业的应用。由于黄原胶液 的悬浮性、假塑性、理化稳定性、食用安全性 和良好的配伍性,使它在食品行业有广泛的 应用,可作为稳定剂、乳化剂、増稠剂、分散剂 和品质改良剂等,如在饮料中可悬浮果肉、并 保持良好的罐装性,在冷冻食品与冰淇淋中 可控制冰晶、抗融化、延长保存期、提高膨胀 率等,在肉制品中可増加持水性、提高出品 率、延长货价期、抑制淀粉的回生,在蛋糕中 可使蜂窝组织均匀、质体松软、延长松软时 间、富有弹性和良好的保湿性,在乳制品中可 増加粘度、防止脂肪上浮、提高热稳定性,在 罐装蔬菜中可降低脱水率、抗酸败、延长储藏 期等,在果酱中不折砂、酱体细腻均匀、涂抹 性好、不结块等。 
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7刘秀芳,王修垣,崔文华等.微生物学报,^
覆盖面己达30多个行业,除了钻井液和食品 添加剂外,还用于陶瓷、搪瓷玻璃、医药、农 药、印染、香料、化妆品、胶粘剂、消防等行业, 如使用黄原胶代替黏土作为釉浆悬浮剂和粘 结剂,使陶瓷和搪瓷产品的釉面平整、光亮、 滋润,产品合格率提高了 40%并降低了烧 结温度、减少了烧成遍数,降低了琅粉用量, 改善了劳动环境;又如利用黄原胶研制成功 的凝胶型抗溶泡沫灭火剂,避免了普通金属 皂抗溶灭火剂必须在使用时相混、输送管道 长不能超过200米的限制。
5建议
从国外黄原胶行业的发展趋势和国内黄 原胶的研究现状来看,黄原胶的制备,要提高我国的黄原胶 生产工艺水平,需要加强对下列课题的研究:
(1)开发适合高粘非牛顿系的新型高效 的机械搅拌式发酵反应器,提高生产强度和 产品质量;
(2)开发新型的分离提取方法,降低分 离提取的能耗和成本;
()开展黄原胶发酵动力学的研究,建 立发酵过程的数学模型,对生产过程和产品 质量进行自动控制;
(4)増加黄原胶产品的规格,研究黄原 胶的使用方法;
()通过对黄原胶进行化学改性等方 法,进一步拓展黄原胶产品的市场。
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