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黄原胶降解酶放线菌筛选及发酵工艺研究

发布日期:2014-10-16 09:47:31
黄原胶降解酶放线菌筛选及发酵工艺研究先容
黄原胶降解酶放线菌筛选及发酵工艺研究:
黄原胶降解酶放线菌筛选及发酵工艺研究,黄原胶是植物致病菌野油菜黄单胞菌所分泌的胞外多糖,其主链类似纤维素很难降解,可作为 生物胶用于增稠剂、悬浮剂、乳化剂和稳定剂,还能引起十字花科植物黑腐病。筛选分离对黄原胶有显著降解 作用的放线菌,以生物方法降解黄原胶,降解产物黄原胶寡糖可有效防治黑腐病,具有开发为生物农药的潜 力。【方法】从自然土壤样品中进行分离筛选、纯化、16SrRNA鉴定及诱变选育,获得高效降解黄原胶放线菌 菌株,通过发酵工艺研宄,确定最适产酶条件。【结果】优化产酶培养基配方为:蔗糖3%,(NH4)2S()4 0.5%, KNO31%,酵母膏0.1%。菌株发酵产酶培养条件为:发酵温度28°C7.5,500 mL瓶装量为150mL,底物浓 度0.5%,接种量为5%。【结论】获得一株高效降解黄原胶的链霉菌sp.),优化其产黄原胶降解酶 的摇瓶培养基及培养条件,发酵液黄原胶降解酶的酶活达到200 IU/L。
黄原胶(Xanthan gum)是一种由野油菜黄单抱菌(Xanthomonas campestris)分泌的中性水 溶性多糖,简称XC,又称汉生胶。黄原胶由于其独特的剪切稀释性质,良好的増稠性,理想的乳化稳定 性,对酸、碱、热、反复冻融的高度稳定性,以及对人体的完全无毒害等许多优良的特性,在食品、石油、医 药、日用化工等十几个领域中有着极其广泛的应用11’2]。黄原胶降解是如今研究的热点,特别是研究酶 法降解更有重要的意义。黄原胶是一种植物毒素因子,能引起十字花科植物黑腐病。黄原胶生物降解产物黄原胶寡糖不仅可抑制野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)生长,还可阻止其合成毒素因子黄原 胶。同时,黄原胶寡糖还部分抑制野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)所分泌的作为致病因子的某些 酶的活性,如纤维素酶、几丁质酶、果胶酶和蛋白酶等。总之,黄原胶寡糖有明显的防治野油菜黄单胞菌 引起十字花科植物黑腐病的作用,有开发为生物农药的潜在优势。而且功能性寡糖多来自于细胞壁多 糖水解,在植物诱抗、抑制病原菌、増强免疫力、改善胃肠功能等方面具有重要生理活性,可进一步开发 利用[3,4]。【前人研究进展】1980年,Rinaudo等首次发现纤维素酶可部分降解处于无序构型的黄原胶,
但对于多数处于规则螺旋构型的黄原胶几乎无降解作用。1999年,Ruijssenaas分离出的黄原胶降解菌 Paenibacillu afeinOyticus XL- 1能降解约28%黄原胶分子,但却只能降解侧链,对主链几乎无降解作用。
近来,中国科学院大连化学物理研究所的黄成栋、刘晗等从土壤中分离出一株鞘氨醇单胞菌属 (Sphngomoms)的菌株XT- 11,并初步分离纯化出了该降解酶。黄原胶在工业领域应用广泛,但其主 链类似纤维素很难降解。降解黄原胶的常用方法有物理法(加热、超声波等)、化学法(酸、碱、氧化剂 等)、酶解法(生物法)。用物理化学降解方法能耗高,环境危害大。其中酶解法以其降解过程容易控制、 反应条件温和以及对环境没有污染等优点成为黄原胶降解的首选途径15’6]。【本研究切入点】然而,黄 原胶的工业应用也产生了一些问题,如采油过程中使用黄原胶可提高采油率,但也増加了原油的黏度,
使后续工艺如油料运输及产品纯化的成本増高,为此需要找到能方便降解黄原胶的方法。【拟解决的关 键问题】从自然土壤中进行分离筛选,纯化鉴定,获得产高活性黄原胶降解酶的菌种,通过发酵工艺研 究,优化产酶条件,以实现黄原胶的生物酶降解。
1材料与方法
1.1采集土壤样品
放线菌多存在于土壤耕作层,因此广泛采集南北疆肥土土壤样品17]。
1.2筛选降解黄原胶的放线菌
1.2. 1富集培养土壤中降解黄原胶的放线菌
根据黄原胶0. 1%、0. 4%、0. 5%和0. 7%的浓度对比实验结果,确定富集培养液中黄原胶的浓度为 0. 5%。方法:凉水中加入0. 5%黄原胶,搅拌使其溶解,分装50 mL到250 mL三角瓶中,灭菌,每瓶加入 1 g 土样,置摇床中培养,30 °C,200 r/min,2 d后肉眼观察黏度变化,并用黏度计(1#转子,ffi r/min)测黏 度,选取黏度下降明显的富集培养液进行放线菌分离。
1.2.2分离富集培养液中的放线菌
取富集培养液的10- 7~ 10- 8稀释液1 mL涂布到高氏培养基平板,30 °C培养箱里培养2 d,挑取生长 出的放线菌单菌落镜检,并划线纯化后保存。
高氏培养基:淀粉 2%,KN〇3 0. 1%,K2HPO4 0. 05%,MgS〇4.7H2〇 0. 05%,NaCl 0. 05%,FeS〇4.7H2〇 0. 001%,琼脂2%。制法:将可溶性淀粉加入少量水调成糊状加热澄清再加其他成分,每30 mL培养基 中加3%重铬酸钾1 mL,以抑制细菌和霉菌的生长,pH调至7. 9~ 8. 1,高压灭菌。
1.2.3筛选降解黄原胶的放线菌
将分离到的放线菌点接到黄原胶筛选固体培养基平板(以黄原胶为唯一碳源),在30°C的培养箱 里,培养2d,筛选菌落生长且出现较大透明圈的菌株。
黄原胶筛选培养基[8]:黄原胶 0. 45%,KN〇3 0. 1%,K2HPO4 0. 05%,MgS〇4* 7H2〇 0. 05%,NaCl 0. 05%,FeS〇4.7H2〇 0. 001%,琼脂 2%,pH7. 0。
1.3菌种诱变及筛选l8’9]
1.3.1菌种诱变
将1.2. 3筛选得到的降解黄原胶能力最强的放线菌菌株作为出发菌株,进行紫外线诱变,选育黄原 胶降解酶的高活性放线菌突变菌株。
紫外线诱变法:出发菌株接种到黄原胶摇瓶培养基(Bennett’s)培养(30°C,200 r/min,过夜),离心 (5 000 r/min,3 min),以PBS缓冲液清洗3次,收集菌体,用PBS缓冲液将菌体稀释至1tf/mL左右的菌 悬液,紫外线处理(30 min,60 min),在搅拌器上边搅拌边紫外线照射。
PBS 缓冲液:Na2HP〇4 30. 6 g,NaH2P〇4 2. 5 g,定容至500 mL,121 °C灭菌 30 min。 
1.3.2突变菌株筛选
平板筛选:诱变处理过的菌悬液离心(5 000 r/min, 3 min),以PBS缓冲液清洗3次,收集菌体,用PBS
缓冲液稀释,涂布黄原胶筛选培养基,在30 °C的培养箱里培养2 d,挑取尽量不一样的单菌落,划斜面保
存。
摇瓶筛选:将平板筛选到的透明圈大的菌株接种到黄原胶摇瓶培养基,黄原胶降解酶放线菌筛选及发酵工艺研究,先把挑选的放线菌接到摇瓶 培养基,30 °C,200 r/min,培养3 d,然后加黄原胶,再培养6 d,测定发酵黏度,黏度下降最多的菌株即为 黄原胶降解的优良菌株。
黄原胶降解放线菌摇瓶培养基(Bennett’s):酵母膏0. 1%,牛肉膏0. 1%,葡萄糖0. 1%,酸水解酪蛋 白0. 2%,麦芽浸粉0. 2%,pH 7. 3~ 8. 0,高压灭菌。
黄原胶黏度测定方法:取含降解菌的黄原胶发酵液,25 °C,2#转子,60 r/min条件下,用NDJ- 5S型 旋转式黏度计进行测定。
1.4菌种鉴定
通过细菌的16S rRNAl10]测序法鉴定筛选的放线菌菌株。
1.5摇瓶发酵工艺研究
以Bennett’s为出发培养基,通过不同碳源、不同氮源的单因子筛选试验和正交试验进行发酵培养 基成分的优化,以提高菌株产生黄原胶降解酶的酶活。
1.5.1碳源单因子筛选试验
培养基pH 7. 0,培养条件为:装液量100 mL/ A 500 mL、温度28 °C、转速150 r/min、培养时间72 h。 表1
表1碳源单因子筛选试验设计 Table 1 Single factor selecting experiment for carbon source
培养基编号
IIIIIIVvn
葡萄糖0. 1%0. 1%0. 3%----
麦芽糖0. 2%--0. 3%---
麦芽浸汁-0. 2%-----
蔗糖----0. 3%--
淀粉-----0. 3%-
不加糖-------
酵母膏0. 1%0. 1%0. 1%0.1%0. 1%0. 1%0. 1%
牛乳膏0. 1%0. 1%0. 1%0.1%0. 1%0. 1%0. 1%
酸水酪蛋白0. 2%0. 2%0. 2%0. 2%0. 2%0. 2%0. 2%
1.5.2氮源筛选试验
培养基pH 7.0,培养条件同1.5. 1。表2
表2氮源筛选试验设计 Table 2 Selecting experiment for nitrogen source
培养基编号
IIIIII
蔗糖0. 3%0. 6%0. 6%
酵母膏0. 3%0. 2%-
牛乳膏0. 3%--
KNO3-0. 2%0. 3%
酸水解酪蛋白0. 3%--
(NH4) 2S〇4-0. 1%0. 3%
豆饼粉--0. 3%
1.5.3培养基成分筛选正交试验
根据营养条件的单因素实验结果,确定正交实验的考察因素及其水平,选取碳源(蔗糖),混合氮源
腿〇3、酵母膏和(NH4hSO+设计4因素3水平的正交实验,培养基pH 7. 0,培养条件同1. 5. 1。表3 1.6发酵培养条件的优化
在1.5优化培养基成分的基础上,研究温度、pH和通气对酶活的影响,优化摇瓶发酵工艺。
1. 6. 1培养温度对酶活的影响
优化培养基条件下,测定不同培养温度17、28和37°C对发酵液酶活的影响,其余培养条件同1.5. 1。 1. 6. 2培养基pH对酶活的影响
优化培养基条件下,测定发酵培养基pH分别为6、7.5、8. 5、时发酵液的酶活,其余培养条件同 1. 5. 1。
1.6.3通气量对酶活的影响
优化培养基条件下,A500 mL三角瓶分装50、100、150和200 mL等不同体积的液体发酵培养基,黄原胶降解酶放线菌筛选及发酵工艺研究,即 通过装液量的不同来模拟不同通气量,测定其对发酵液酶活的影响,其余培养条件同1.5. 1。
同时进行平底瓶和凹底瓶对照试验。
1.7酶活测定方法
黄原胶酶的酶活力定义:为每分钟催化形成相当于1 WmoL葡萄糖的还原末端所需的酶量为1个酶 活力单位。
酶活力的测定方法:文献^]。
2结果与分析
2.1采样及菌株初筛
在南北疆各10个点野外采样,共采集40份土壤样品,通过富集培养后,分离得到60多株放线菌菌 种,通过黄原胶唯一碳源平板的多次筛选,得到24株有透明圈的放线菌菌株,根据抑菌圈的大小,初步 筛选出4株黄原胶降解作用较好的菌株。其中,6, 9, 17, 18号放线菌形成的透明圈较大,说明其降解黄 原胶能力较强。表3
表3初筛菌株在黄原胶筛选平板上的透明圈 Table 3 Transparent circle formed by strains from the first screening on xanthan media
菌株编号圈直径(cm)菌株编号圈直径(cm)
40L 6190. 5
51201.2
62. 1211.4
71.3231.5
81. 2241. 35
91. 5310. 8
100. 7320. 8
121330. 55
141. 2340. 6
161.25350. 9
171. 5381. 15
181.6300. 8
2.2突变菌株筛选
以6号菌株为出发菌株进行紫外诱变,在黄原胶为唯一碳源的平板上观察诱变菌株透明圈大小,选 取透明圈大的菌株,与出发菌株同时点接平板,比较透明圈的大小,得到1株比出发菌株透明圈直径増 力口 36%的诱变菌株M39。
2.3菌种鉴定
通过菌体表观特征、菌落形态、生理生化鉴定等传统细菌分类鉴定以及细菌的16S rRNAl10]基因序 列测序分析,M39鉴定为链霉菌(Strptomyces sp.)。
2. 4菌株M39发酵培养基的优化
2. 4. 1不同碳源对发酵液黄原胶降解酶酶活的影响.shing H〇use_ A11 rights reserved_ http://www.cnki.net 
根据表1的试验设计,测定不同碳源对发酵液黄原胶降解酶酶活的影响。黄原胶降解酶放线菌筛选及发酵工艺研究,不同碳源对发酵液黄原 胶降解酶酶活的影响较大。蔗糖作为碳源时酶活最高。表4 2. 4. 2不同氮源对发酵液黄原胶降解酶酶活的影响
根据表2的试验设计,测定不同氮源对发酵液黄原胶降解酶酶活的影响。处理I、II和II分别为 19. 2、6. 8和30. 2 IU/L。研究表明,不同氮源其发酵液酶活差异较大,其中II号酶活最高。
表4不同碳源对发酵液黄原胶降解酶酶活的影响 Table 4 Influence of carbon source on xanthan- degrading enzyme activity of fermentation liquid
处理
IIIIII!VVIvn
第一批次26. 931.129.42831.821.524.1
第二批次18. 717.420.520. 322.319.717. 4
第三批次12. 521.214. 322. 028.622. 821. 1
平均数19.423. 221. 423.427.621.320. 9
提高率-7.2%11%2. 4%12%32%1. 9%-
注:酶活单位为IL/L
2.4.3发酵培养基的正交优化实验
根据2. 4. 1和2. 4. 2的结果,确定正交实验的考察因素及其水平,选取碳源(蔗糖)、KN〇3、酵母膏和 (NH4)2S〇4,作为正交实验的4个因素,并分别设计3个水平。表5
表5培养基正交实验设计 Table 5 Orthogonal test of culture media composition
因素
水平ABCD
蔗糖(NH4)2S〇4KNO3酵母膏
10. 6%0.1%0.1%0. 1%
22. 0%0. 3%0. 5%0. 5%
33. 0%0.5%1.0%1.0%
序号ABCD
11111
21222
31333
42123
52231
62312
73132
83213
93321
R值的大小顺序为D> B> C> A,所以4个因素对黄原胶降解作用的影响程度顺序为A> C> B>
D,即:蔗糖>1(抑〇3> (NH4)2S〇4>酵母膏。最佳组合为A3B3C3Q。优化后培养基组成为:蔗糖3%,
(NH4) 2SO4 0. 5%,KNO3 1%,酵母膏0. 1%。发酵液的酶活大于200 IU/ L。表6
2.5发酵培养条件的优化
2. 5. 1不同培养温度对发酵液酶活的影响
17、8和37 °C培养温度下,发酵液酶活显示,28 °C培养温度下,发酵液酶活力最高。图1 2. 5. 2不同培养基pH对发酵液酶活的影响
培养基pH分别为6、. 5、. 5、时,发酵液酶活显示,当培养基pH为7. 5时,发酵液酶活力最高。
图2
2. 5.3通气量对酶活的影响
不同装液量时发酵液酶活,当A500 mL三角瓶装液量为150 mL时,发酵液酶活最高。图3 平底瓶和凹底瓶对照试验结果显示,平底瓶培养比凹底瓶培养的发酵液酶活更高。图3和图4的 结果都表明M39对通气量的要求不高。
 讨论
黄原胶是一种应用广泛的微生物多糖,但关于其降解菌株的研究报道国内很少见,而且都是细菌。 国外较偏重于对降解机理、编码降解酶的基因等理论的研究,国内则更重视对降解产物的应用研究。
黄原胶降解是如今研究的热点,特别是研究酶法降解更有重要的意义。酶法反应条件温和,选择性 相对较好,是理想的降解多糖制备活性寡糖的方法。并且,利用生物酶来降解黄原胶,可以深入了解黄 原胶的结构和合成机理,也有助于探讨黄原胶构效间的关系,制备具有新的理化特性的黄原胶,提高黄 
原胶的工业应用效果,制备有特殊生物活性的寡糖产品。
n/nl)想嫌
 
研究中,从土壤中筛选得到的放线菌,可高效降解黄原胶,能够显著降低黄原胶的黏度,并且优化了 菌株产生黄原胶降解酶的培养基组成和发酵条件,后续可进一步研究黄原胶降解酶的酶学特性、降解产 物生物活性以及开发不同功效的黄原胶寡糖产品,具有潜在的应用前景。
图3装液量对发酵液酶活的影响
Fig. 3 Influence of medium volume on enzyme activity of fermentation liquid
 
50ml100ml150ml200ml
4 结论
研究从自然土壤样品中进行分离筛选、纯化、16S rRNA鉴定及诱变选育,黄原胶降解酶放线菌筛选及发酵工艺研究,获得1株高效降解黄原胶 放线菌菌株链霉菌(Streptomyces sp.)。
对菌株进行摇瓶发酵工艺研究,优化了产黄原胶降解酶的培养基组分及培养条件,发酵液酶活达到 200 IU/L。优化得到的产酶培养基配方为:蔗糖3%, (NH4) 2SO4 0. 5%, KNO3 1%,酵母膏0.1%。菌株发 酵产酶培养条件为:发酵温度为28 °C, pH值为7. 5, 500 mL瓶装量为150 mL,底物浓度0. 5% ,接种量为5%。
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