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壳聚糖羧甲基纤维素膜的制备及预防肠粘连的实验研究

发布日期:2014-11-09 11:27:52
壳聚糖羧甲基纤维素膜的制备及预防肠粘连的实验研究先容
壳聚糖羧甲基纤维素膜的制备及预防肠粘连的实验研究:
壳聚糖羧甲基纤维素膜的制备及预防肠粘连的实验研究,制备壳聚糖羧甲基纤维素膜并探讨其预防肠粘连的效果。方法:将壳聚糖和羧甲基纤维素按1: 1质量比混 合,加入戊二醛、硫酸铝铵双交联,甘油增塑后烘干成膜;测定膜的拉伸强度及断裂伸长率并行电镜扫描。48只SD大鼠随机 分成为3组(n= 16),2组擦伤其回肠浆膜,制成肠粘连模型,于损伤部位分别包裹壳聚糖羧甲基纤维素膜、壳聚糖膜;另一组 不作处理作为对照组。术后第14天观察各组肠粘连情况。结果:膜拉伸强度约为20 MPa,断裂伸长率约为65%;扫描电镜 (SEM)显示膜表面结构呈相互交错的纤维状,表面有不规则的孔状结构。壳聚糖羧甲基纤维素膜组和壳聚糖膜组的粘连程 度显著低于对照组(P<0.01)。光镜下见壳聚糖羧甲基纤维素膜、壳聚糖膜组炎症反应轻微,纤维增生不显著;对照组粘连处 纤维组织增生活跃,局部炎症反应明显。透射电镜下见壳聚糖羧甲基纤维素膜组上皮细胞修复较壳聚糖膜组好,成纤维细胞 增生不明显,对照组上皮细胞增生较慢,成纤维细胞分泌胶原功能活跃。结论:壳聚糖羧甲基纤维素膜适于术中缝合需要, 预防肠粘连效果显著,性能优于壳聚糖膜。
在施行腹腔、心血管、脊柱、关节及肌腱等部位 的外科手术后,普遍存在手术性粘连问题。术后粘 连不仅会影响手术效果,还可导致严重的术后并发 症,甚至会使一个成功手术归于失败,因此防止术后 粘连一直是研究者努力解决的问题。目前国际上采
解,需二次手术取出,己逐渐被可降解吸取的隔离材 料所取代。聚乳酸虽为可降解材料,但其缺陷在于 降解产物呈酸性,局部蓄积易产生轻微无菌性炎症,预防粘连仅为物理屏障作用[1]。壳聚糖作为天然可 降解吸取的生物材料,由于其独特的生物相容性和 降解性目前己被广泛用于医药领域。许多研究[2~ 4] 表明,壳聚糖不但能有效预防粘连,还可促进正常上 皮细胞的生长。壳聚糖可制成不同的剂型,如凝胶、 溶液、海绵状以及薄膜等,但其缺点是溶液、凝胶易 流动,不易在局部形成较高浓度,而单纯应用壳聚糖 制成海绵状及薄膜机械强度及韧性不够。为此,我 们首次尝试将壳聚糖和具有良好成膜性、可降解吸 收的防粘连材料羧甲基纤维素混合改性,制备能满 足临床需要可缝合的壳聚糖复合膜,并观察其抗粘 连效果,为进一步产业化提供实验依据及理论基础。
1材料和方法
1.1实验材料壳聚糖羧甲基纤维素膜的制备, 将硫酸铝铵固体加入蒸馏水中,在50~ 60°C加热下 使其溶解,配成0. 15%浓度的硫酸铝铵溶液。将壳 聚糖固体和羧甲基纤维素固体按质量比1 : 1用电 子分析天平称取。先将称取的羧甲基纤维素固体缓 慢加入硫酸铝铵溶液中,在室温下用磁力搅拌器快 速搅拌(20 r/min)至溶解,再缓慢加入称取的壳聚 糖固体继续搅拌至完全溶解配成1.5%的溶液。然 后加入甘油(终浓度为0. 8%)搅拌,再加入戊二醛 (终浓度为0.003%)充分搅拌均匀。将溶液放入真 空干燥箱中脱泡(真空压力达0. 1 MPa)至细密小气 泡脱尽为止。按每盒10 ml标准加入5 cm x 5 cm 的不锈钢盒中,最后放入隔水式恒温干燥箱中在 60~ 70°C下干燥成膜。用医用铝铂袋包装密封,Y 射线60Co(2. 5 kGy,5 h)照射消毒备用。壳聚糖膜 又名粘停宁,可降解防术后粘连膜,烟台万利医用品 有限企业生产(产品批号:41208122407021)。
1.2壳聚膝羧甲基纤維素膜拉伸强度及断裂伸长 率的测定膜宽20 mm,夹持长度40 mm,拉伸速 率为20 mm/min,通过电子拉力测试机测量。按下 面公式计算:拉伸强度=P/ (b • d),其中P为膜断 裂时负荷(N),b为膜宽度(mm),d为膜厚度(mm); 断裂伸长率=(G- G。)/ G0X100%,其中G。为膜 初始有效长度(mm) ; G为膜断裂时测量线之间的长 度( m m) 。
1.3 膜扫描电镜(SEM)检测用SEMS>250型扫
描电子显微镜观察壳聚糖■羧甲基纤维素膜的表面 结构形态及膜的共混相容性,所用样品尺寸为1. 5
为 15 kV。
1.4实验动物及分组成年SD大鼠48只,由第 二军医大学实验动物中心提供,体质量250~ 280 g, 雌雄不限,随机分为3组,每组16只。
1.5实验方法为避免麻醉药物及穿刺对腹腔实 验结果的干扰,全部动物均用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)股后肌肉注射麻醉。动物麻醉后仰卧位固 定于平板上,剪除腹毛,脱毛剂脱毛,消毒术野,铺 巾。在无菌操作下取下腹正中切口,长约3 cm,打 开腹腔后找出回盲部将其提至切口外,然后距回盲 部近端2 cm处用干纱布反复轻轻擦拭回肠前侧面的 浆膜面,使浆膜受损(约0.5 cm x 3 cm)至表面有针尖 状出血点为止,但不要造成穿孔。经上述处理后分别 在2组大鼠创面覆盖一张1 cm x 4 cm的壳聚糖■羧甲 基纤维素膜或壳聚糖膜,用S0可吸取缝合线将边缘 固定2~ 3针;剩下一组大鼠创面暴露不作任何处理 作为对照组。然后将肠送回腹腔,用3^0的可吸取缝 合线缝合逐层关腹。术后动物禁食12 h,分笼饲养。 术后连续3 d每天肌注庆大霉素4 U预防感染。14 d 后以同样的麻醉方法开腹检验、取材。
1.6 各项指标的观察
1.6.1 —般情况比较2种膜在手术中的可操作 性、体内残留情况,动物饲养存活情况。
1.6.2肠粘连情况为能更好的观察腹腔粘连情 况,再次腹腔切口时包含原正中切口在内的、以底朝 下的“U”型切口切开腹腔,然后将腹壁组织瓣向上 掀起暴露腹腔。肠粘连程度参照Philips 5级分级 标准[5],肠粘连程度为:0级,完全无粘连,回肠浆膜 面修复良好;I级,回肠与周围组织少量粘连,疏松 易分,无渗血,经处理的浆膜面同周围的肠壁、系膜、 腹壁间的粘连面积占经处理的浆膜面面积百分比< 25%; II级,壳聚糖羧甲基纤维素膜的制备及预防肠粘连的实验研究,回肠与周围组织轻到中度粘连,肠管可 呈“ U”形,分离时局部有渗血,上述部位间的粘连百 分比为26% ~ 50%; III级,肠管与周围组织广泛粘 连,较难分离,无肠梗阻,上述部位间的粘连百分比 为51%~ 75%; IV级,肠管与周围组织紧密粘连成 团,分离困难,引起肠梗阻,上述部位间的粘连百分 比为 76% ~ 100%。
1.6.3光镜观察每组随机各取3只大鼠的创面 部位肠管,用10%中性甲醛溶液固定,经脱水、透 明、浸蜡、包埋等步骤制成5 Um石蜡切片。常规H~ 
cm x L5 cm,膜的表面真空喷偏白照,加速电压E染色,观察浆膜创面修复情况。 
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第7期.肖海军,等.壳聚糖羧甲基纤维素膜的制备及预防肠粘连的实验研宄 
1.6.4电镜观察每组随机各取3只大鼠的创面 部位肠管,用2. 5%戊二醛溶液预固定,1%锇酸后 固定。经系列丙酮脱水,环氧树脂Epon812浸透、 包埋、聚合。定位后行连续超薄切片,醋酸铀枸橼酸 铅电子染色,PHILIPS CM-120透射电子显微镜下 观察浆膜面细胞超微结构。
1.7统计学处理数据用SPSS 11. 0统计App包
处理,采用x2检验。
2结果
2. 1壳聚膝羧甲基纤維素膜各项指标观察拉伸 强度约为20 MPa,断裂伸长率约为65%。扫描电 镜显示:膜较致密,没有发生相分离,膜表面结构呈 相互交错的纤维状,表面有不规则的孔状结构 (图 1)。
 
图1壳聚糖■羧甲基纤维素膜表面扫描电镜图 Fig 1 Chitosaitcarboxymethylcelluiose membrane by SEM ( x 2 000)
2.2术后-般情况壳聚糖膜包裹肠壁后,虽然能 缝合,但缝合线切割易拉豁,放置20~ 30 min左右 就变成凝胶状态;而壳聚審羧甲基纤维素膜包裹肠 壁后紧密黏附与浆膜创面,至手术完毕仍保持完整 形态,而且能用可吸取缝合线缝合。术后第3天壳 聚糖膜组动物死亡1只,死因为麻痹性肠梗阻;术后 第9天对照组死亡1只,死因为广泛肠粘连导致绞 窄性肠梗阻。术后第14天开腹观察术区,壳聚糖膜 和壳聚糖■羧甲基纤维素膜形态己完全消失。
2.3术后肠粘连评分壳聚糖羧甲基纤维素膜 组、壳聚糖膜组的肠粘连主要属0~ II级,对照组的 粘连主要为111~ IV级,壳聚糖羧甲基纤维素膜组、 壳聚糖膜组粘连程度明显低于对照组(P< 0. 01)。壳聚糖羧甲基纤维素膜的制备及预防肠粘连的实验研究, 壳聚糖羧甲基纤维素膜组粘连程度大于I级的有2 33. 3%,壳聚糖羧甲基纤维素膜组的粘连程度略轻 于壳聚糖膜组。详见表1。
表1三组动物肠粘连分级情况 Tab 1 Results of intestinal adhesion in 3 groups
(n)
GroupN0IIIIIIV
CCM1668200
CM1546410
Control1500258
CCM: Chitosai- carboxymethylcenulose membrane; CM: Chitosan membrane
2.4光镜观察结果壳聚糖羧甲基纤维素膜组: 浆膜层创面己大部分修复或完全修复,上皮细胞连 续,少量成纤维细胞,胶原纤维疏松,组织炎症反应 轻微(图2A);壳聚糖膜组:浆膜层创面己大部分修 复,成纤维细胞轻度増生,周围有胶原纤维,组织炎 症反应轻微(图2B);对照组:浆膜面未修复,粘连处 纤维组织増生活跃,多量成纤维细胞及大量胶原纤 维,局部炎症反应明显(图2C)。
2. 5透射电镜观察结果壳聚糖羧甲基纤维素膜 组:浆膜层创面有上皮细胞覆盖,细胞扁平,修复的 上皮细胞接近正常,胶原分泌不活跃(图3A,取材自 壳聚糖羧甲基纤维素膜组I级粘连的大鼠小肠); 壳聚糖膜组:浆膜层创面有上皮细胞覆盖,细胞扁 平,部分细胞表面微绒毛缺失,基膜不完整,局部浆 膜下成分如胶原纤维等暴露于最上面(图3B,取材 自壳聚糖膜组I级粘连的大鼠小肠);对照组:浆膜 层创面上皮细胞完全消失,成纤维细胞和间质处于 最表层,其周围有大量胶原纤维,成纤维细胞呈多角 形,核不规则,粗面内质网増生扩张,高尔基体发达 (图3C,取材自对照组III级粘连的大鼠小肠)。
3讨论
肠粘连主要是由于手术创伤、局部缺血、异物存 留、细菌感染、出血等导致的炎性反应。炎症引起血 管通透性増加,纤维蛋白原渗出,形成纤维蛋白沉 积,炎性细胞和受伤的间皮细胞产生纤溶酶原激活 抑制物,导致纤维蛋白溶解作用降低,另外成纤维细 胞増生,分泌胶原纤维,多种因素造成永久性纤维粘 连[6]。而纤维蛋白原渗出増加和间皮细胞在腹膜粘 连形成中可能扮演重要作用,这些病理改变多发生 
只,占]2. 5%,壳聚糖膜组1级以上有5只,占在腹腔术后10 d内。因此,有学者认为,肠粘连预 
 
图2各组光镜观察结果
防的重点应放在尽量减少纤维蛋白原渗出和促进腹膜间皮的生长时期[7]
Fig 2 Results of 3 groups under microscope( I-E, x 40)
 
A: The wounded serosawas uninterrupted a^id almost completely renovated. There were a few fibroblasts with loose collagen and mild ikiflammatoiy; B: Most wounded seiosa was renovated, fibroblasts proliferated a little; and there was a small amount of collagen with mild inflammatory; C: The wounded serosa was not renovated. There were a large number of fibroblasts in adhesive parts with a great amount of collagen. The inflammatory was obvious
图3各组电镜观察结果
Fig 3 Results of 3 groups under electron microscope( x 6 000)
A: The wounded serosa was covered by flat epithelia. Fibroblast was not active; B: The wounded serosa was covered by flat epithelia absent of microvillus and fundus membrane. Part of collagen were exposed on the surface of wounded serosa; C: The wounded serosa was covered by po¬lygonal fibroblast, without epithelia. Fibroblast was full of cytoplasm, rough endoplasmic reticulum and golgiapparatus, surrounded by largea- m ou nt of c ol la gen 
壳聚糖具有抗感染、止血、抑制成纤维细胞生长 及机械隔离的作用,并能在体内自动降解,其作为预 防腹膜粘连的生物材料进行开发利用己被逐渐重 视,并在动物实验及临床中证实了壳聚糖凝胶具有 抗腹膜粘连的作用[2,8]。但是将壳聚糖凝胶涂布于 腔内,随后被降解吸取或术后引流排出,而不易在局 部形成较高的浓度,从而使其发挥作用的时间缩短, 作用强度减弱。将壳聚糖制成薄膜用于临床虽然取 得了良好的效果['但从本实验的结果来看,壳聚糖 膜放入腹腔后变成凝胶时间太快,膜形态只能维持 
腹腔创面后,凝胶可发生流动而迅麵于整个腹2〇~扣而,方面不利于手术操作,.另1纖很 
难发挥膜的作用。为了解决上述问题,本实验将壳 聚糖和羧甲基纤维素混合经戊二醛、硫酸铝铵双交 联制成的生物膜有如下优点:(1)具有一定的机械强 度。经检测拉伸强度可达20 MPa,扫描电镜显示膜 较致密,没有发生相分离,膜表面结构呈相互交错的 纤维状,表明膜的强度得到了明显的加强,实验中手 术操作以及缝合也验证了其效果。(2)马建标等[10] 采用流延法制备壳聚糖膜,发现加入甘油能够改善 膜的亲水性、水通透性以及顺应性。大家在膜的制 备过程中也加入甘油来増加膜的顺应性。经检测壳 聚糖羧甲基纤维素膜断裂伸长率65%,实验中观察 发现膜在湿态下能黏附于损伤的肠壁并随肠管的蠕 动表现出良好的顺应性。(3)膜变成凝胶时间较壳 聚糖膜延长,能够在创面局部形成较高浓度,増加作 用强度。(4)创面完全愈合后能够很快的降解吸取, 不会干扰腹腔内的正常生理环境。
羧甲基纤维素同样也具有良好的生物相容性以 及可降解吸取的特性,并有预防粘连及不干扰创面 愈合的作用[11,12]。有实验证实,羧甲基纤维素在腹 腔中发挥抗粘连的作用是由于具有类似于体液,如 滑膜液的黏滞性,在上皮细胞再生期间可起到“漂浮 浴T或“水化漂浮作用”,阻隔浆膜面与腹膜面从而防 止粘连的形成;削弱成纤维细胞的活性或増殖,防止 纤维蛋白沉积于受损的浆膜面;并防止纤溶酶原从 创伤表面的除去,増加其活化作用的有效性[12]。因 此,羧甲基纤维素加入到壳聚糖中制成的生物膜,可 充分发挥两种生物材料不同防粘连机制的互补作 用。
由本实验结果可见,壳聚糖和羧甲基纤维素制 成的生物膜有显著的预防粘连作用,壳聚糖羧甲基纤维素膜的制备及预防肠粘连的实验研究,壳聚糖羧甲基纤维素膜的制备及预防肠粘连的实验研究,术后肠粘连主 要属0~ II级,在统计学上与壳聚糖膜作用无明显 差异。但壳聚糖羧甲基纤维素膜组粘连程度大于 I级的只有2只,占12. 5%,壳聚糖膜组I级以上 有5只,占33. 3%,可见壳聚糖羧甲基纤维素膜组 的粘连程度比壳聚糖膜组略轻。从光镜及超微结构 观察来看,壳聚糖羧甲基纤维素生物膜能促使损伤 的肠壁浆膜层上皮细胞覆盖,创面修复略好于壳聚 糖膜,这可能与壳聚糖羧甲基纤维素膜中壳聚糖能 促进上皮细胞生长、抑制成纤维细胞生长的生物学 特性以及壳聚糖在局部保持较高浓度有关。
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