联系大家 / Contact

  • 澳门威利斯人88038
  • 联系人:王伟
  • 电 话:0533-8299008 13280657534
  • 手 机:13280657534
  • 传 真:请填写您的传真
  • 邮 箱:sddachina@163.com
  • 网 址:http://www.sdcmcchina.com/
  • 地 址:山东省淄博市周村区开发区工业园16号

黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的研究

发布日期:2014-12-01 11:43:28
黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的研究先容
黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的研究
黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的研究绪论
1.1黄原胶及撕究历史
微生物代谢胶也称生物胶,是微生物在生长代谢过程中,在不同外部条件下产生的多糖。 他们通常可分为三大类:细胞壁多糖、细胞内多糖和细胞外多糖。微生物多糖的商品化生产主 要取决于:⑴该多糖的性质及应用价值;(2)提取工艺的可行性;(3)生产成本;⑷使用 安全性。细胞壁多糖和细胞内多糖由于提取难度大、成本高,开发的品种比较少。大规模工业 化生产的微生物代谢胶大多是细胞外多糖。由于微生物代谢胶不像植物胶那样易受气候及其他 因素的影响,国际上对多种微生物代谢胶的研究颇为热门。目前以商业化应用的主要有黄原胶、 结冷胶、凝胶多糖、葡聚糖和酵母多糖等,而迄今为止只有黄原胶和结冷胶被国际食品立法机 构允许广泛用作食品添加剂。
黄原胶(Xanthan gum)亦称汉生胶,它是以碳水化合物为主要原料,用野油菜黄单胞杆菌, 经微生物有氧发酵制取的胞外多糖,其水溶液具有独特的流变特性一“剪切稀化”,剪切速率增 加,溶液的表观粘度明显下降;剪切速率减小,表观粘度恢复原状,是一种典型的假塑性流体。
黄原胶分子是由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸、乙酸和丙酮酸构成的“五糖重复单 元,,结构聚合体,相对分子质量在2乂1〇6?办107[1],所含乙酸和丙酮酸的比例取决于所用菌株和 发酵条件。黄原胶聚合物骨架结构类似于纤维素,但是黄原胶的独特性质在于每隔一个单元上 存在的由甘露糖醋酸盐、终端甘露糖单元以及两者之间的一个葡萄糖醛酸盐组成的三糖侧链。 侧链上的葡萄糖醛酸和丙酮酸群赋予了黄原胶负电荷。带负电荷的侧链之间以及侧链与聚合物 骨架之间的相互作用决定了黄原胶溶液的优良性质。黄原胶的分子结构见图1.1。
20世纪50年代中期,美国农业部北部研究中心在制定开发“有用的微生物调查”中Jeanes等 人发现了黄原胶,60年代Peoria实验室首先用微生物发酵去获得了黄原胶。1961年美国Kelco企业 首先采用野油菜黄单胞杆菌NRRLB-1459开始黄原胶的半工业化生产。其产品主要用于油田的钻 井泥桨配制及采油工艺过程。1963年正式工业化生产。此后研究发现,甘蓝黑腐病黄单胞杆菌、 锦葵黄单胞杆菌、胡萝卜黄单胞杆菌、木薯萎蔫病黄胞杆菌、美人蕉枯叶黄单胞杆菌等都能产 黄原胶[2]。美国经过多年毒理学实验,1969年食品与药物管理局(FDA)批准黄原胶作为食品添 加剂,其后欧洲各国相继批准黄原胶在食品工业中的应用。1975年黄原胶载入美国药典,并公 布了质量标准。1983年联合国世界卫生组织(WHO)和粮农组织(FAO)也批准黄原胶作为食 品工业用稳定剂、乳化剂、增稠剂。
1
 
目前,已有10多个国家和地区生产黄原胶,主要有美国、英国、法国、日本、俄罗斯、德 国和中国。国外主要生产厂家有美国的Kelco企业、Pfizer企业,法国的Rhone-Poulene企业、 Nero-Rousselotsatia企业等。其中美国Kelco企业是世界上最大的黄原胶生产厂,Rhone-Poulene
企业位居第二。随着市场的不断扩大,Miles企业和CecaSA企业也加入其生产行列,美国ADM 企业正在着手建设大规模黄原胶生产装置,发展势头良好。在美国和西欧约有30%?40%的黄原 胶用于石化行业。据统计,1975年用于钻井泥桨的黄原胶为1800吨,1980年就达到3000余吨。 根据世界石油组织估计,全球石油行业钻井和三次采油方面远期需要黄原胶90?100万吨,足 见其巨大的市场潜力。黄原胶工业化生产技术日趋完善,尤其是生物技术的发展使黄原胶的发 酵产率、糖转化率、发酵液胶浓度等指标大大提高,发酵周期明显缩短。目前,世界上黄原胶 生产的最高水平已达到50m3单罐发酵年产量200?240吨;淀粉投料质量分数由4%?5%提高 到8%?9%;发酵黄原胶质量分数已达到5%左右;原料多糖转化率撕80%;发酵周期由72? 96h缩短为48?52h[2]。
我国黄原胶研究起步于20世纪70年代末,主要研究单位有:南开大学、山东省食品发酵 研究所、无锡轻工大学、山东大学、中国农科院、上海化工研究院、四川省抗菌工业研究所、 郑州工业大学生化中心和河南省科学院生物所等。1979年南开大学生物系首次分离得到一批黄 原胶菌株,并提纯鉴定了这种酸性多糖。1985年率先在国内研究食品级黄原胶,并于1986年通 过了食品级黄原胶产品和生产菌株的毒理学安全性试验。经国家有关部门病理学试验与毒性试
2
验后,1988年8月卫生部批准了食品级黄原胶的卫生标准,并被列入食品添加剂名单。黄原胶 发酵液属于高粘度的非牛顿型流体,国内前期试产黄原胶的几家工厂由于发酵设备(主要是溶 氧问题)和后提取工艺的问题,都没能形成规模生产。1992年江苏金湖制药厂建成国内第一家 黄原胶生产厂,全国产量不足100吨,1993年以后,由于国内需求不断扩大,黄原胶价格持续 上扬。到2001年,全国产量迅猛增加,总产量已超过1.5万吨/年,其中山东中轩生物制品有限 企业产量最大,近1万吨/年,其他厂规模都较小。据国家轻工业局规划发展司1999年8月提出 的《食品生物工程标志性目标》预测,到2005年,我国食品黄原胶需求量将达到3万吨/年。而 据石油行业专家预测,在石油钻井和三次采油方面需要黄原胶10万吨/年以上。由此可见国内 黄原胶仍具有巨大的潜在市场。国内大约有45%的黄原胶作为食品级销售,40%用于石油工业, 15%用于农药、饲料、日化、环保等行业。目前,我国黄原胶产量50%以上出口,国际市场非 常广阔(10万吨/年以上),国内市场潜力很大。
1.2黄原胶的理化麵及其应用[3]
黄原胶是性能较为优越的生物胶,具有独特的理化性质,集增稠、悬浮、分散、乳化、稳 定等性能于一身。
1.2.1假塑蔽性
黄原胶溶液是一种典型的假塑性流体其溶液粘度随剪切速率的增加而明显降低。在高剪切 速率下,聚合体结构解聚为无规则线团结构,使粘度迅速降低;当剪切速率解除时,分子结构又恢复 至IJ双螺旋网状聚合体状态,使溶液粘度瞬间恢复到最大。黄原胶的假塑t生对食品工业有重要价值, 如作为食品添加剂,有利于改革泵送和灌注工艺,便于固形物的混合,可节省能源,提高工作 效率。同时,添加了黄原胶的食品在食用时口感细腻,有利于风味的释放。
1.2.2增稠性
黄原胶具有良好的增稠性皞特别是在低质量浓度下具有很高的粘度。3x10-1g/L的黄原胶溶 液能产生0.09Pa • S的有效粘度黄原胶溶液的粘度是同质量浓度下明胶的100倍。黄原胶用于 印染业,可控制桨的流变性质,防止染料迁移,使图纹清晰。搪瓷工业使用黄原胶作增稠剂, 使搪瓷表面涂膜均一。在石油工业中,黄原胶可用于调配钻井泥桨以增加其粘度和控制流变性 能并可作为驱油剂,提高采油率。
1.2.3稳定性
黄原胶溶液在一定的温度范围内?93。〇反复加热冷冻,其粘度几乎不受影响,10g/L 黄原胶溶液由25°C加热到120°C,其粘度仅降低3%。
黄原胶溶液对酸碱十分稳定,在pH5?10其粘度不受影响。能和许多盐溶液混溶,粘度不受影 响。它可以分别在 100g/L KCl,100g/L NaCl,100g/L CaCl2和50g/L Na2C〇3溶液中长期存放90d(25
3
°c),粘度几乎保持不变。由于此性质,在石油钻采工业中采用黄原胶作泥桨增稠剂和采油驱油 剂,可保证在特殊地带的正常钻探。黄原胶在强酸强碱条件下仍保持良好的增粘性,可广泛应 用于油漆、造纸、化妆品、医药和农药等方面。
许多酶如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和半纤维素等都不能使黄原胶降解。
1.2.4悬浮性和乳化性
由于黄原胶理化性质稳定,因而具有良好的悬浮性和乳化性。10g/L的黄原胶溶液具有约 5x10-4N/cm2的承托力。黄原胶借助于水相的稠化作用,可降油相和水相的不相溶性,能使油脂 乳化在水中,因此它可在许多食品饮料中用作乳化剂和稳定剂。
1.2.5与增稠剂的臓性
黄原胶可与大多数合成的或天然的增稠剂配伍,如和槐豆胶、瓜尔胶、卡拉胶及魔芋胶等 都能互溶,溶后使混合胶粘度显著提高。
1.3黄原胶的生产
1.3.1菌种
黄原胶发酵的菌种一般采用野油菜黄单胞杆菌嚇甘蓝黑腐病黄单胞杆菌),此外菜豆黄 单胞菌、锦葵黄单胞菌和胡萝卜黄单胞菌亦可作为发酵菌种。我国目前已开发的菌株有南开-01、 山大-152、农-008、农-005和L4。这些菌株一般呈杆状,革兰氏染色阴性,产荚膜,无芽抱,有 极生鞭毛,专性好氧[4],生产菌株通常采用冷冻干燥保存。
优良的品种对于产品的得率和品质有着至关重要的影响。国外有报道,有人采用基因重组 技术将黄原胶生产菌中的产胶基因进行测序、分离、筛选并表达,但尚未见到重组菌种用于工 业化的报道。如果能采用基因工程的手段将黄原胶生产菌种中的产胶基因分离出,再导入新的 完整的菌株中,使其具有双产胶基因或更多的产胶基因并稳定遗传,将会使黄原胶的产量成倍、 成数倍的增长[5]。
1.3.2生产工艺
目前国内外都在黄原胶的发酵工艺方面开展了很多研究,以提高产量和质量,国内的研究 主要集中在培养基配方和工艺改进方面,而国外的研究热点则为黄原胶的发酵动力学和代谢网 络分析,从各个角度阐述黄原胶的高产机理,并在此基础上改进工艺,使产量得到提高问。
黄原胶发酵可以是分批发酵、半分批发酵或者连续发酵。在工业生产中,通常采用通气搅 拌发酵罐进行分批深层发酵。工业生产步骤如下:发酵,乙酹冗淀,第一次干燥,乙醇/水混合 物洗涤,干燥,碾磨,质量控制和分装。菌株接种于含有碳源、氮源和无机盐的营养培养基中 活化,经过生长,培养物可以接种于逐级放大的发酵罐中,从而达到工业化的规模。
物质的吸取及代谢产物的排泄;G)影响酶的活力和酶的生成;⑷影响氧的溶解和发酵液的 氧化还原电位。氧化还原电位的改变,关系到细胞内一系列氧化还原反应能否进行。发酵前期 如果pH偏低,细菌生长和糖耗快,但菌体容易衰老,表现在发酵进入中、后期时糖耗变慢,黄 原胶生成减少。如果pH偏高,贝瞒体增殖受到抑制,细胞代谢不活跃,不仅长菌和糖耗慢,黄 原胶生成量也少。黄单胞杆菌生长的最适pH值在6?7.5之间,而生产黄原胶的最适pH值范围 是在7?8。研究表明,黄原胶发酵培养基的起始pH控制在7.2?7.5时,有利于初期的细胞生 长和后期的黄原胶合成。在发酵过程中,pH值会下降,但在整个工业发酵过程中,可以通过控 制pH接近中性,直到碳源耗尽。
发酵温度不仅影响黄原胶的产率,还能改变产品的结构组成。发酵前期和中期温度过高,细 胞容易衰老,进入发酵后期时,细胞活力降低,糖耗慢,黄原胶生成速率减慢。如发酵温度过 低,不仅长菌慢,发酵周期延长,而且细胞代谢缓慢,产胶率降低。研究指出,较高的温度可 提高黄原胶的产量,但降低了产品中丙酮酸的含量,因此如需提高黄原胶产量,应选择温度在 31 °C?33 °C,而要增加丙酮酸含量就应选择温度范围在27°C?31 °C。
种龄及接种量对黄原胶生产也有一定影响。种龄的长短关系到种子活力的强弱,影响下一 次增殖的适应期长短.接种量的多少则明显影响种子生长期的长短。由于分泌出的黄原胶包裹在 细胞的周围,妨碍了营养物质的运输,影响了菌种的生长,因此,接种阶段时除应增加细胞的浓 度外,还应尽量降低黄原胶的产量。
野油菜黄单胞杆菌为好氧细菌,所以氧气对于细菌生长和生产黄原胶来说是必需的。通常 发酵液中的溶氧浓度影响到黄原胶产生菌的生长速率、黄原胶的生成率以及黄原胶的质量。高 浓度细菌随着发酵的进行发酵液粘度不断增大,体积传质系数降低,造成供氧能力逐渐下降, 合成速率变慢,产率降低。充足的氧气供应是有效生产高聚物并获得高产率的前提条件,而溶 氧浓度的高低则与生物反应器的结构有着直接而重要的关系。可以通过搅拌培养基来提供氧气, 但是,在生产过程中,当培养基粘度增加时,氧气的供应就越来越困难。在很大程度上,搅拌 受到发酵罐形状、液体体积、搅拌方式和叶轮性质的影响。应用能够增加供氧的叶轮系统和结 构合适的反应器,可以提高黄单胞杆菌生产黄原胶的能力。传统的反应器为搅拌式反应器(STR), 大部分的反应都是通过这种反应器来完成的,但是这种反应器无法克服发酵后期粘度过高而带 来的氧和其他营养物质的传递、交换困难等难题。为增加传递到培养基中的氧气,研究者提出 了各种不同的反应器结构,如许平1990年提出用泵式静态混合循环反应器可增加氧气在高粘度 发酵液中的传递速率[11],从而使黄原胶产量得至腦高;而气升式反应器能有效解决发酵过程中 的通气和搅拌所带来的热量问题,适合连续培养生产黄原胶[12]。  
1.3.3分离提取
黄原胶分离提取的目的在于按产品质量规格的要求,黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的研究,将发酵液中的杂质不同程度地除去, 通过分离、纯化、干燥等手段获得成品。黄原胶发酵液中有菌体细胞、未消耗完的碳水化合物 和无机盐等杂质,此外发酵液中还存在大量的水分需要除去。黄原胶的分离纯化是个成本很高 的步骤,后处理占到整个生产成本的50%。提取的主要步骤:细胞的沉淀,黄原胶的沉淀、脱 水、干燥、研磨。黄原胶发酵液具有较高的粘度,处理非常困难,其中菌体细胞的去除是提取 工艺的一大障碍。目前有多种方法可灭活发酵液中的菌体:酶法成本较高;化学试剂容易改变 pH值,而降低产品中的丙酮酸含量;因此一般采取巴氏灭菌法,此法由于温度较高还可提高黄 原胶的溶解度,并在一定程度上降低了溶液的粘度,有利于随后的离心或过滤。由于黄原胶发酵 液的粘度很高,过滤前需要稀释(稀释剂一般为水、酒精或含低浓度盐的酒精),以利于菌体 细胞和杂质的去除和黄原胶的沉淀,常用的方法有离心法,过滤法,酶降解法,次氯酸盐氧化 法,过滤-超滤浓缩'法。黄原胶的沉淀分离一般采用乙醇、异丙酹沉淀法,这种方法是利用黄原 胶在某些溶剂和某些条件下失稳凝聚而沉淀的原理,将黄原胶从发酵液中提取出来。溶剂沉淀 法工艺简单、产品质量高、大型化生产技术成熟,为目前国内采用的主要生产方法。但是该方 法溶剂用量大,需配置溶剂回收设备,回收成本较高使黄原胶总成本持高不下,相对商业价值 较低,限制了黄原胶的推广和应用。
1.4研究内容及意义
至|J目前为止,世界上黄原胶均采用发酵法生产,一般采用的是间歇式的生产工艺,生产装 置最大可达到几十立方米。主要流程为:菌种-摇瓶一种子放大一发酵一后处理-烘干-粉碎一成 品包装。由于黄单胞杆菌体积很小、强度很低,黄原胶的发酵过程是一个比较典型的气液两相 混合生化反应过程。
黄原胶独特的化学结构为其提供了优良的使用性能,但也正是因为黄原胶的独特结构,黄 原胶在发酵过程中,随着发酵液中黄原胶的浓度逐渐增大,发酵液的流体性质也从牛顿型流体 转变为高度假塑性的非牛顿型流体,而且这种转变是在浓度很低的情况下发生的,这种特性导 致了整个发酵过程在黄原胶浓度很低的状态下就进入传质、传热的控制过程,使氧的传递非常 困难,反应器内分区现象严重,发酵过程的溶氧效率大幅下降,物料混合严重不均,生物热很 难及时移出,使反应器内存在很大的浓度和温度梯度,各点发酵程度严重不均,这些问题的存 在使得黄原胶产品分子量分布宽、丙酮酸含量低、产品质量不一致。要解决以上问题,必须从 混合工程角度出发进行深入的研究。
国内对黄原胶的研究主要集中在生物化学和食品应用等方面,对发酵工程、产品后处理和 动力学方面的研究很少。对挡板和气体分布器的影响则没有探讨。总的来说,基础性、机理性
7
的研究很少,无法对黄原胶生产技术,特别是发酵技术的改进提供有价值的意见,使得国内发 酵工艺很不合理。如目前国内厂家多采用了多层直叶圆盘涡轮等不恰当的反应器内部构件,难 以满足黄原胶发酵过程中溶氧和传热、传质的需要。
国内黄原胶技术研究存在的问题正是大家需要研究的方向,很显然,要全面解决黄原胶生 产技术中存在的问题,首先应该从发酵工程的角度入手,并引用化学工程中处理高粘度体系的 成功方法,进行以下几方面的工作:
I、对现有的黄原胶发酵体系的培养基成分、操作工艺条件进行优化研究,并在一定的放大 水平上进行进一步的研究,以获得具有产业化价值的数据。
II、参照化学工程对中高粘、假塑性的非牛顿型流体体系的一系列有效研究方法,深入研 究反应器型式、内部构件等对发酵过程各参数以及产品性能的影响,开发适合高粘非牛顿流体 的高效新型机械搅拌式生物反应器。
III、在前面两项工作的基础上,对新型机械搅拌式生物反应器进行if价。
基于以上想法,本研究主要内容分为两部分:
⑴冷模部分
研究了不同桨型组合对搅拌功率尸,氧传质系数尤说、气含率e的影响,针对黄原胶发酵的 特性,筛选出一组能够促进整体对流,提高气液混合效果的新型搅拌器,将其应用于黄原胶发
酵。
⑵热模部分
结构因素及培养基(碳源、氮源、无机盐等)、发酵温度、周期、气量、转速等工艺因素对 黄原胶发酵的胶产率、丙酮酸含量等主要技术指标的影响,探讨各项技术指标与结构因素及工 艺因素之间的关系。
为完成以上研究内容,课题组采取先分别进行冷模和热模研究,然后根据两部分研究的初 步结果进行合并研究的方式,获得了对实际发酵体系有实用价值、而且对实际生产技术有一定 引导意义的研究数据和结论,确定了在实验条件范围内生物反应器的最佳桨型组合。
8
二、黄原胶发酵工艺的优化
2.1前言
目前国内外研究学者都在黄原胶的发酵工艺方面开展了很多研究,以提高黄原胶的质量和 产品得率。黄原胶的生产受到多方面因素的影响,诸如原料的选择、原料的合理配比、菌种选 育、发酵工艺、后处理工艺、生产设备等,国内的研究主要集中在培养基配方和工艺改进方面。 不同的黄原胶生产菌株对培养基成分级发酵条件有着不同的要求,本文在三角瓶水平上针对 XG-101黄单胞杆菌发酵培养基的成分配比进行了优化研究,并从工业生产的实际情况出发,考 察了淀粉液化程度对黄原胶产率的影响。以此为基础放大到30L机械搅拌式生物反应器上深层 培养,在此水平上对黄原胶的发酵条件进行优化,得到XG-101黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的最 佳工艺条件,为进一步研究黄原胶的发酵工程奠定基础。
2.2实验材购方'法 2.2.1菌种
菌种野油菜黄单胞菌iXanthomonascampestris) XG-101,本实验室保:存菌种。
2.2.2实验伩器
B.E.MARUBISHICO.LTD., JAPAN;
曰本尼康
上海一恒科学仪器有限企业 上海一恒科学仪器有限企业 上海一恒科学仪器有限企业 上海博迅实业有限企业医疗设备厂 上海福玛实验设备有限企业 上海分析仪器厂
全自动生物反应器MSJ-U3 YS100显微镜 DZF-6050型真空干燥箱 DHG-9245型鼓风干燥箱 LRH-250型生化培养箱 YXQ-LS-50SII型立式压力蒸气灭菌器 QYC-211型空气恒温振荡器 U-3400型分光光度计 2.2.3培养基
菌种斜面培养基(g/L):淀粉5.0,牛肉膏3.0, NaCl5.0,蛋白胨10.0,琼脂15.0?20.0,初 始pH值7.4。
菌种扩大培养基(g/L): (NH4) 2SO4 1g/L, MgSO4 0.12g/L, CaCO, 2g/L,酵母浸粉2.4g/L, 淀粉10.6g/L,葡萄糖2.1g/L,初始pH7.4。
发酵培养基(g/L):淀粉40g/L,豆粉6g/L, CaC〇32g/L,初始pH7.4。
2.2.4实验方法 2.2.4.1培养方法
9
斜面种子培养:接种针直接挑取菌种进行接种,28°C下生化培养箱中培养48h,取出放入冰 箱4。。保藏。
液体种子培养:每瓶摇瓶种子培养基接一环活化斜面菌种,置于200r/min恒温摇床,28 C 恒温振荡培养26小时。
摇瓶发酵培养:按每瓶一环活化斜面菌种的量接种于液态摇瓶发酵培养基,黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的研究,置于200r/min恒 温摇床,28°Cf旦温振荡培养96小时。
生物反应器及其运行射牛:反应器的有效容积为30L,配备有两层搅拌桨,T/D=05 D=0.3m; 发酵液的溶氧浓度DO值采用原电池型溶氧电极插于两层搅拌桨之间自动检测;采用1%的 H2SO4溶液和1%的NaOH溶液自动控制调节发酵液的pH值;发酵温度26C,转速800r/min, 通气比为1:1vvm,发酵周期90小时。
2.2.4.2菌体形态的观察
取不同发酵阶段的黄原胶发酵液,稀释、涂片、染色,油镜下观察黄原胶在不同发酵时期 的基本形态。
2.2.4.3发酵培养基的优化
根据野油菜黄单胞杆菌的培养特性,结合野油菜黄单胞杆菌的生物学特性,利用均匀试验 方法网优化其培养基配方。根据一定的基础开究结果,选用均匀试验设计表U10* (103),优化 试验的因素水平表见表2.1。
2.2.4.3淀粉液化程度对黄原胶产率的影响
在黄原胶的工业化生产过程中,为了降低搅拌难度,使灭菌彻底,通常在灭菌前需要向培养 基中加入一定量的a-淀粉酶,使培养基中的淀粉液化,但淀粉的液化程度(a-淀粉酶的加入量 和液化时间)对黄原胶的产率有着明显的影响。本文采用单因素法分别考察了 a-淀粉酶 (20000U/ml)的用量和液化时间对发酵液中黄原胶浓度的影响。
2.2.4.4发酵餅的优化
将上述优化出的培养基配方放大到30L的机械搅拌式生物反应器中进行深层培养,在原有发 酵餅的基础上,采用三因素三水平的正交试验[,寸影响黄原胶发酵生产最为显著的三个因素: 温度、通气量和搅拌转速进行了优化。根据正交试验设计的基本原理,选用L934表中的1、2、3 三列,设计了如表2.2所示的3因素3水平的正交试验表。
10 
Tab.2.1 the table of three factors in 10 levels uniform-test
序号因素
X1X2X3
10.40.81.2
20.80.60.12
31.20.360.4
41.60.560.24
52.00.320.08
62.40.520.36
72.80.280.2
83.20.480.04
93.60.240.32
104.00.440.16
Xi淀粉浓度:0.4?4.0 g/L;X2豆粉浓度:0.24?0.6g/L; 乂3碳_丐浓度:0.04?0.4g/L
表2.2三因素三水平正交实验表 Tab.2.2 the table of three factors in 3 levels orthogonal-test
序号因素
XiX2X3
1260.83600
2261.0800
3261.21000
4280.83800
5281.01000
6281.2600
7300.831000
8301.0600
9301.2800
X1温度:26--28°C; X2通风比:0.83 ?1.2 L-L-1;X3 織:600 ?1000 r/min
11
 
2.3实验结果与讨论
2.3.1菌体形态的变化
 
ab
 
cd
图2.1菌体形态的变化
Fig.2.1 Variation ofmycelium morphology of XG-101
图2.1中a、b、c、d分别是摇瓶培养至第20、26、32、38小时XG-101黄单胞杆菌的菌体
油镜照片,从图中可以看出这几个阶段菌体形态变化十分明显。第20小时,菌体个体较小,以 短杆状存在,形态比较丰满。第26小时,菌体长轴不断加长,由短杆状变为长杆状。这一阶段 菌体生长迅速,菌体显著加长表明细胞壁和细胞膜的扩展速度超过DNA的复制速度,这对黄原 胶的合成非常有利,因为黄原胶合成的酶系和磷脂载体都存在于细胞膜上[7]。此外,大部分菌体 的中间处有分段的迹象,此时菌体已经开始进行分裂繁殖。第32小时,菌体周围出现透明圈, 开始分泌黄原胶。最先分泌的黄原胶都是源于菌体的端部,然后扩展到菌体四周,这可能是菌 体端部是新生壁,比较薄的缘故。此时菌体主要以杆状存在,也有些部分菌体以链状存在。
因为F>F.05 (3, 6),这表明y的变化主要是由于X1、X2、X3的变化弓起的,回归方程②可 信。对回归方程进行分析,在上述各项参数优化的范围内,培养基配方中淀粉和豆粉含量越高 发酵液中黄原胶浓度就越高,因此大家取其优化范围内的最大值。碳酸钙作为培养基中的无机 盐对发酵液中黄原胶浓度影响较小,但却是不可缺少的,本着节省原材料而又不影响发酵液中 黄原胶浓度的原则,大家取其优化范围内的中间值,由此得到黄原胶发酵培养基的最佳配方见 表 2.4:
表2.4黄原胶发酵培养基最佳配方
Tab.2.4 optimum medium components for Xanthan gum fermentation
淀粉(g/100mL)豆粉(g/100mL)碳酸钙(g/100mL)
40.60.2
优化号的计算值区间可用下式估算y = y* 士 p a xS③
式中:y*为优化号按照②式的计算值,y* = 2.81 S为标准差S = 0.12
p a为置信水平为a时的标准正态变量,查表得(pa0.05) =1.96 则 y = 2.81 ±0.22
即y值得范围应为2.59?3.03g/100mL。
对上述优化出的培养基进行摇瓶培养验证,其结果见表2.5:
表2.5黄原胶发酵培养基验证结果 Tab.2.5 verification result for Xanthan gum fermentation
平行实验标号12
黄原胶浓度(g/100mL)2.852.92
平均浓度(g/100mL)2.88
上述结果表明,按优化条件进行摇瓶培养,发酵液中黄原胶浓度均在预测范围内,且两次 实验发酵液中黄原胶的平均浓度为2.88 g/100mL,也在预测范围内,其结果高于表2.3中的每次 实验结果,由此可认为优化出的上述摇瓶培养基配方是可靠的。
在黄原胶生产中,发酵培养基是决定生产成功与否的重要因素之一,它不仅对黄原胶的产量
14
影响很大,而且对产物的质量和性能也有一定的作用。此外还影响到工业生产的成本,因此选 择适合工业生产的发酵培养基是非常重要的[15]。
2.3.3淀粉液化程度对黄原臟酵的影响
2.3.3.1 a-淀粉酶用量对黄原胶发酵的影响
(I曰00I/M)姻崧铛M舾
0-
0 L
00.511.522.5
淀粉酶用量(U/g淀粉)
30L机械搅拌式生物反应器黄原胶发酵的放大实验中,灭菌之前需要向培养基中加入一定量 的a-淀粉酶,本文采用单因素法在三角瓶水平上对a-淀粉酶的用量进行了初步研究,分别以正 常淀粉酶用量(100U/g 淀粉)的 0 倍、1/3200、1/1600、1/800、1/400、1/200、1/100、1/50 的量 向发酵培养基中加入a-淀粉酶,60°C时液化2min。发酵结束后,用酒精直接沉淀法提取黄原胶, 计算发酵液中黄原胶浓度,分别以a-淀粉酶用量和发酵液中黄原胶浓度为纵横坐标绘制曲线, 得图2.2。
图2.2发酵液中黄原胶浓度与a-淀粉酶用量的关系 Fig.2.2 Relationship between concentration of Xanthan gum in the broth and application rate ofdosage
由图2.2知发酵液中黄原胶浓度与a-淀粉酶用量有着明显的关系,当a-淀粉酶用量为 0.25U/g淀粉时,发酵液中黄原胶浓度最大。通常在以淀粉质原料为碳源的微生物发酵中,灭菌 前需要向培养基中加入适量的淀粉酶,使淀粉液化,其目的主要是降低培养基的粘度,促进传 热,使灭菌更加彻底,其次淀粉液化可以产生一定量的葡萄糖,为发酵初期菌体生长提供所需 的葡萄糖。葡萄糖碳源不仅是合成黄原胶的基质,也是菌体增殖的物质基础,黄原胶的产量与 碳源种类和底物浓度有着直接的关系。当a-淀粉酶用量不足0.25U/g淀粉时,淀粉液化不能产 生足够的葡萄糖以供菌体生长棚,影响了后期黄原胶的合成,致使发酵液中黄原胶浓度降低。
15
a-淀粉酶用量超过0.25U/g淀粉时,淀粉液化比较充分,产生大量的葡萄糖,培养基中葡萄糖浓 度过高使渗透压增大,抑制了菌体生长,导致黄原胶产率降低。
2.3.3.2淀粉的液化时间对黄原胶发酵的影响
n日00I/M)姻崧铛M舾
 
2.45 L
024681012
液化时间(min)
发酵培养基中按淀粉酶最佳用量添加a-淀粉酶,60°C处液化,黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的研究,液化时间分别为0分钟、2 分钟、4分钟、6分钟、8分钟、10分钟。液化结束后,迅速使a-淀粉酶失活。接种发酵后用酒 精直接沉淀法提取黄原胶,计算发酵液中黄原胶浓度,分别以液化时间和发酵液中黄原胶浓度 为纵横坐标绘制曲线,得图2.3。
图2.3发酵液中黄原胶浓度与液化时间的关系 Fig.2.3 Relationship between concentration of Xanthan gum in the broth and liquefaction time
由图中变化曲线可知,淀粉的液化时间在2分钟时,发酵液中黄原胶浓度最大,当液化时 间不足2分钟或超过2分钟时,发酵液中黄原胶的浓度均低于2分钟时的黄原胶浓度。淀粉作 为迟效碳源,在a-淀粉酶的作用下液化生成一部分葡萄糖,淀粉液化程度与a-淀粉酶用量和液 化时间有着直接关系,a-淀粉酶用量一定的情况下,液化时间越长,培养基中的葡萄糖就越多, 越不利于黄源胶的发酵。其原因可能是,葡萄糖作为速效碳源可以直接被菌体生长所利用,当 培养基中葡萄糖浓度过高时产生降解阻遏效应。葡萄糖分解代谢的降解物能够抑制腺苷酸环化 酶活性并活化磷酸二酯酶,降低cAMP的浓度,使许多分解代谢酶的基因不能转录,而黄原胶 作为含有对降解物敏感的微生物受到降解物的阻遏[16],影响了产胶。
通常在工业生产中,以淀粉质原料为碳源的培养基,在灭菌之前需要加入一定量的a-淀粉 酶使淀粉液化,淀粉液化的同时会产生一定量的葡萄糖,而发酵初期培养基中的葡萄糖浓度对
16
发酵液中黄原胶的浓度有着明显的影响,通过控制淀粉的液化程度可以控制葡萄糖的浓度。淀 粉的液化程度可以通过a-淀粉酶的用量和液化时间来进行控制,合理的淀粉酶用量及液化时间 有利于提高黄原胶的产率,因此在黄原胶的工业生产中对于淀粉液化程度的研究也是十分有意 义的。
2.3.4发酵餅的优化
在上述优化培养基配方、最佳a-淀粉酶用量及液化时间的基础上将黄原胶发酵放大到30L的 机械搅拌式生物反应器中进行深层培养。采用正交实验法,对影响黄原胶发酵生产的最为显著 的三个因素:温度(°C)、通气量(L.L-1)和搅拌转速(r/min),进行优化研究。优化结果见表 2.6。
表2.6三因素三水平正交实验结果 Tab.2.6 result of three factors in 3 levels orthogonal-test
实验序号黄原胶浓度(g/100mL)
12.8
23.21
33.04
42.78
52.85
62.72
72.69
82.57
92.64
对上述结果按照正交实验设计方法进行数据处理,有下列回归方程: y = ac + a1x1 + a2x2 +a3x3⑤
式中x1、x2、x3分别表示发酵条件中的温度、通风比、转速。
对上述方程进行计算机回归,可以得到下列回归方程:
y = 5.2639 - 0.1x1 + 0.0588x2 +0.0004x3⑥
其中标准差s = 0.1, F = 8.64,样本数N = 9,自变量M =3,置信水平a = 0.05,查表得到 F.05 (3,5) =5.41。
因为:F>F.05 (3, 5),这表明y的变化主要是由于X1、X2、X3的变化弓丨起的,回归方程⑥
可信。对回归方程进行分析,参数温度的系数为负值,对黄原胶发酵的影响是相反的,即在给
17
定范围内温度越小越有利于黄原胶的发酵,因此大家取其最小值;通风比、转速的系数均为正 值,对黄原胶发酵的影响是积极的,即发酵过程中通风比和转速越高越有利于黄原胶的发酵, 但考虑到生物反应器的实际承受能力大家取其中间值。因此在本实验条件范围内,黄原胶的最 佳发酵条牛见表2.7:
表2.7黄原胶的最佳发酵条件
Tab.2.7 optimum conditions for Xanthan gum fermentation
温度/C通风比/ L-L-1转速/r-min
261: 1800
在最佳培养基配方、or淀粉酶用量及液化时间的基础上对上述发酵条件进行验证,两次验 证结果的黄原胶浓度分另ll为3.03g/100ml,3.17 g/100ml。验i正结果远高于发酵条牛优化之前的黄 原胶浓度(2.7 g/100ml)。
2.4小结
本章探讨了黄原胶发酵过程中菌体形态的变化、发酵培养基配方、淀粉液化程度及发酵条件 对黄原胶生产的影响。通过对黄原胶发酵过程中不同阶段菌体形态的观察,揭发了黄原胶的发 酵本质,为黄原胶的生产提供理论依据;在原有发酵培养基配方研究的基础上,应用均匀实验 法对培养基中的主要成分淀粉、豆饼粉和碳酸钙进行优化,得出了黄原胶发酵生产的最佳培养 基配方为:4g/100ml淀粉、0.6g/100ml豆饼粉、0.2g/100ml碳鹏丐;在黄原胶的放大发酵过程中, 对淀粉的液化程度进行了初步研究,确定了影响淀粉液化程度的a-淀粉酶的加入量及液化时间, 研究结果表明or淀粉酶的最佳用量和液化时间分别为:酶活力为20000U/m啲情况下,每克淀粉 的用量为0.25U,液化2分钟;最后结合上述实验结果,在30L机械搅拌式生物反应器水平上对黄 原胶发酵的条牛进行了优化,得最佳发酵条牛为:温度26°C、通风比1: 1 vvm、搅拌转速800r/min。
实验结果表明,在此最佳实验条件下采用酒精直接沉淀法时,发酵液中黄原胶的浓度均在 3.0以上。据报道由美国专利4, 119, 546所制备的发酵液,黄原胶浓度为3.36 g/100ml;山东大 勞工伯英等人[17H棚黄单胞菌S-152所得发酵液黄原胶浓度最高为2.78 g/100ml;中科院微生物所 王修垣等人以4%蔗糖为底物、由黄单胞杆菌L4生产的发酵液中黄原胶浓度网为2.82 g/100ml;本 实验发酵液中黄原胶浓度3.01%,高于或接近上述文献值。  
三、新型勝器的雛 3.1引言
黄原胶水溶液是典型的非牛顿流体,在含量较低时就具有很高的粘度。黄原胶的这种特性 给发酵过程中的气液混合、氧的传递带来了很大的困难。国内外研究学者认为氧的传递是影响 黄原胶发酵过程的黄原胶产率、丙酮酸含量、分子量分布等主要参数的限制性因素[19~20]。 A.Amanullah等研究了几种型式的搅拌器在黄原胶发酵液中的混合性能,他认为桨型的选取在获 得全罐混合和气体的微观分散方面具有举足轻重的作用[21]。
对于黄原胶体系的混合问题,国内外开发了一系列的新型反应器,其中包括:带有外循环 的新型气升式反应器[12],通过在外循环中增设静态混合器来提高气液混合效果的新型反应器[22], 通过在气升式反应器的导流筒中增加混合元件来提高气液混合的新型反应器[23]等。然而,机械 搅拌式生物反应器在高粘度非牛顿剪切稀化发酵液中所表现出的一些独特优点,使得该种类型 的装置在黄原胶生产中仍具有很大的开发空间,而搅拌桨作为机械搅拌式反应器中最重要的部 件之一,对气液混合的效果起了决定性的作用,因此选择合适的搅拌桨形式是本研究的关键所 在。本文在0.8%黄原胶水溶液的冷模状态下研究了直叶圆盘涡轮、斜叶圆盘涡轮、凹叶圆盘涡 轮、双折叶圆盘涡轮(上下压式)、六叶布鲁马金不同桨型的双层桨组合对氧传质系数尤说、功 耗八气含率e的影响,研究结果表明当上层桨为下压式双折叶圆盘涡轮,下层桨为六叶布鲁金 时功率消耗较小,而气含率和容积氧传质系数Ka值较高。
3.2实验装置与分析测试:方法 3.2.1实验物系及性能测定
实验中气相介质为空气;液相介质为黄原胶的水溶液,浓度为0.8% (质量浓度)。用成都仪 器厂生产的NXS—11型旋转粘度计,测定物系在室温下的流变特性。
3.2.2实验装置
本实验是在祁調底圆筒型立式釜内进行的,釜径D=378mm,高H= 800mm,液面高度为 740mm。搅拌轴带有扭矩传感器,扭矩传感器与计算机连接,测控App实时测量搅拌轴的转速、 扭矩及功率。搅拌转速为2.5?8.33r/s,气体流量为0?3m3/h。实验装置示意如图3.1所示。   
 
图3.1实验装置示意图
3.2.3搅拌釜内部构件
3.2.3.1气体分布器
本实验釆用的气体分布器为分布环,直径为165mm,黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的研究,环下部均匀分布了 20个直径为2mm 的小孔。分布环离底部的安装高度为60mm。
3.2.3.2 挡板
在浓度为0.8%的黄原胶水溶液中,搅拌器处于过渡流工作状态,甚至接近于层流域,因此 可以考虑釆用无挡板操作。
3.23.3搅拌器型式
根据搅拌器特性和基本的流场分析,设计制作了多种搅拌器。根据黄原胶发酵过程中,黄 源胶发酵液的特点,结合各搅拌器的气液分散能力,本文选用的搅拌桨型式如表3.2所示。  
表3.1本文所用的搅拌桨型式表 Table 3.1 Impellers used in this work
搅拌桨直径(mm)叶片数叶片倾角“。)简记符号
直叶圆盘涡轮12560DT
斜叶圆盘涡轮125645PDTD(U)
六叶布鲁马金1256456BM
凹叶圆盘涡轮12560CBDT
双折叶圆盘涡轮1506盘卜.叶片90,盘下45P2DTD(U)
表中简记符号的D和U分别表示下压式和上推式。上层桨采用上推式时的桨间距为0.55T,上层桨采用下 压式时的桨间距为0.7T。T为釜径。
从黄原胶发酵液的实际情况出发,以强化混合效果、提高流动循环量为目的,桨型组合的 原则采取底层用径流式搅拌器,上层用混合流式(主要为轴向流,有部分径向流)搅拌器,因此 在选取双层组合桨时底层桨采用DT、6BM、CBDT,上层桨采用PDTD(U)、P2DTD(U)。这七 种桨中,除六叶布鲁马金外,其余六种桨均为圆盘涡轮桨,之所以采用圆盘涡轮,是由于黄原 胶体系具有剪切稀化的特性,在搅拌过程中很难完全消除分区现象,不同区中的气体流通阻力 不同,因此应该采用叶轮上的圆盘“兜住”可能沿搅拌轴短路“漏掉”的气体,使气体沿径向 分散,以更好地实现全釜的气液混合。
3.2.4实验测量施
32.4.1功率的测量:采用JCZ1型智能扭矩传感器。此传感器配有相应的计算机App,搅拌轴 转速从扭矩及功率尸可由计算机直接读出。搅拌转速通过控制箱上的变频调速器调节。
3.2.42气含率的测量:气体流量0(L/h)用转子流量计测量和调节。根据釜内液位的升高值来计 算气含率
H - H
s=x 100%
H 0
式中场和H分别为釜内(固液)静液高度和通气分散后釜内物料高度。
32.4.3容积氧传质系数疋a的测量
疋a的测定一般基于方程:
dc/dt=Ka(C-C- £■①
式中:Ka为体积溶氧系数(h-1),C为溶液的饱和溶氧值(mol/L),C为溶液中的溶解氧浓度(mol/L), f 为耗氧率(mol.L-1.h-1)。
在金属钴离子存在时,亚硫酸钠能被迅速氧化为硫酸钠。当采用蠕动泵以一定速度向反应 器中加入一定浓度的亚硫酸钠溶液时,此时的耗氧率为:
e=QM/2V②
式中,Q为亚硫酸钠溶液的流加速度,M为亚硫酸钠溶液的浓度,V是反应器的体积。随着亚硫 酸钠溶液的加入,溶氧值不断降低,最终达到稳态,此时dc/dt=0。反应器中的(C/C*)采用 HAMILTON企业生产的Oxyferm 325型溶氧电极进行测量,饱和溶解氧(C*)采用手持式溶氧电 极进行测量。此时,可按式③计算出Ka的值。
KLa=QM/[2 VC (1-C/C*)]③
21
3.3实验结果与讨论
黄原胶发酵过程中,由于胞外多糖的积累,发酵液的粘度增加,特别是发酵中后期,体系中氧 的传递非常困难,发酵液中氧的浓度较低,溶氧浓度成了菌体生长与产物合成的限制性因素,氧 传递速率成为控制整个发酵过程的关键步骤。容积氧传质系数作为反应体系氧传递速率的特 征参数常直接用来表述气液混合的效果。本文在黄原胶的中粘体系下,以容积氧传质系数为 主要参数,兼顾功耗与气含率,对不同的桨型组合进行了筛选。各组桨型组合中底层搅拌器主 要是径流式的,以保证较好的气体分散,上层则采用上推式或下压式的圆盘涡轮搅拌器,以促 进全釜的混合。
3.3.1不同桨型组合对气含率的影响
气含率(釣是表征搅拌槽内气液分散特性的重要参数,它反映的是搅拌体系持气量的大小。 一般认为:在粘性介质溶液中,粘度的升高影响了气体的分散,非牛顿性的加强影响了气体分 散的均匀性,而气体分散的程度和整体均匀性正是决定气含率大小的关键因素。在黄原胶发酵 液这种高粘、非牛顿体系中,由于物质粘度和分子结构的影响,使得气体的分散变得相对困难, 单纯依靠通气并不能带来⑦的明显升高,这时需要在气体分散上进行进一步的考虑。
 
图3.2不同桨型的气含率与单位体积功耗的关系 Fig.3.2 Relationship between gas hold-up of different impeller type and power consumption per volume
由图3.2可以看出,在相同单位体积功耗下,底层桨不论采用何种型式的径流式搅拌器,上 层采用下压式所得到的罐都要高于采用上推式的,与其它组合相比下压式双折叶圆盘涡轮-六
22
叶布鲁马金组合桨的气含率值较高,下压式桨的排出流与气泡的气升方向相反,延长了气体在 釜内的停留时间,有利于气含率的提高。
3.3.2不同桨型组合对容积氧传质系数的影响
图3.3为不同通气量条件下各桨型组合的容积氧传质系数与单位体积功耗的关系,由图可以 看出,在相同单位体积功耗下,下压式双折叶圆盘涡轮-六叶布鲁马金组合桨的容积氧传质系数 明显高于其它桨型组合,而且在单位体积功率增大的情况下容积氧传质系数有增高的趋势。这 可能是由于布鲁马金桨的叶片结构比凹叶叶片边缘形状变化更大,能够形成更大的剪切效果和 湍动,所得气泡较小,即使在气含率较低的清况下,气液接触面积也会较大,加强了气液混合, 使得此种桨型组合的功率消耗更有效的用于物料中气体和液体混合,促进了传质过程的进行。
 
图3.3不同桨型的容积氧传质系数与单位体积功耗的关系 Fig.3.3 Relationship between mass transfer coefficient of different impeller type and power consumption per volume
上层采用下压式双折叶圆盘涡轮、下层采用六叶布鲁马金,两种桨都能在产生径向流的同 时又能产生轴向流,尤其是布鲁马金属于剪切循环兼顾型叶轮,适用于既需要一定剪切、又需 要高循环的场合,而下压式双折叶圆盘涡轮由于其叶片形状的原因同时具有良好的径向气体分 散能力和轴向流体的循环能力,双层桨的合理配合使得这一组合达到了气体分散的相对理想程
度。
3.3.3不同桨型组合对功耗的影响
本着以容积氧传质系数为主要参数,兼顾功耗与气含率的原则,本文还考察了不同通气数
23
条件下桨型组合对功耗的影响。其中通气数—是气穴理论中用来表征气体分散状况的参数,— 值越小气体分散效果越好。崩力/崩8。0为通气量,,为转速,d为组合搅拌器的平均直径。
由图3.4可以看出,在相同通气数条件下,容积氧传质系数最高的下压式双折叶圆盘涡轮一 六叶布鲁马金桨的功率消耗虽不是最低的,但也是比较低的。很显然,要获得好的混合效果, 必须提供足够的单位体积功率,较好的桨型组合应该具有高的传质系数,功耗也较低,上述组 合符合这一想法。在研究组合桨的气液混合性能时,单位体积功耗(州低的组合桨更易于通过 提高转速来增大容积氧传质系数勒。由图3.3可以看出,在相同的操作条件下,下压式双折叶 圆盘涡轮-六叶布鲁马金的/V要明显低于其它的组合,但这种组合桨的却要高于其它组合。 下压式双折叶圆盘涡轮-六叶布鲁马金组合的这种低功耗、高容积传氧系数的特性使之具有很大 的操作空间,这对工业过程的控制是非常有利的。
 
图3.4不同桨型的功耗与通气数的关系 Fig.3.4 Relationship between power consumption of different impeller type and
3.4小结
在传统工业中,常采用双层六直叶圆盘的组合桨来进行气液混合,在这种组合桨中全罐被 分成相对独立的四个区域,造成了整体对流的明显降低。虽然在近桨区域气液还能获得充分的 混合,但由于整体对流的削弱,使得分区重叠部分出现贫氧区,不利于整体混合。
在本实验优化组合桨中,下层采用六叶布鲁马金能寸气体进行充分的分散,上层采用下压 式双折叶圆盘涡轮能寸气体进行进一步的分散、并把流体下推。这种组合桨在釜底形成一个小 的循环区域,而底层搅拌器的上部则由于下压式双折叶圆盘涡轮搅拌器的下压作用形成了一个
24
整体的大循环。这种组合能碰反应器内部的整体对流,提高全罐的溶氧水平,黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的研究,理论上有利于 解决黄原胶发酵后期粘度过高所弓丨起的传质混合困难等问题,为进一步验证这一结论,大家将 此桨型组合应用于机械搅拌式生物反应器黄原胶的发酵,针对发酵过程中黄原胶的浓度、粘度、 淀粉含量等参数的变化与传统的六直叶圆盘涡轮进行了对比研究。
乳酸脱氢酶(分析纯,彡30U/mg ) 还原性辅酶1(分析纯,彡99%) NDJ—79型旋转粘度计 全自动生物反应器MSJ-U3 752型紫外可见分光光度计 HH-S11-N15型电热恒温水浴锅 ZD-2型自动电位滴定仪 4.2.3培养基
中国医药集团上海化学试剂企业 上海虹光化工厂
天津市科密欧化学试剂开发中心 上海三杰生物技术有限企业 上海三杰生物技术有限企业 同济大学机械厂
B.E.MARUBISHICO.LTD.,JAPAN;
上海菁华科技仪器有限企业 龙口市先科仪器企业 上海精密科学仪器有限企业 
菌种斜面培养基(g/L):淀粉5.0,牛肉膏3.0, NaCl5.0,蛋白胨10.0,琼脂15.0?20.0, pH 值 7.4。
菌种扩大培养基(g/L): (NH4) 2SO4 1g/L, MgSO4 0.12g/L, CaCO, 2g/L,酵母浸粉2.4g/L, 淀粉10.6g/L,葡萄糖2.1g/L,初始pH7.4。
发酵培养基(g/L):淀粉40g/L,豆粉6g/L,CaCO,2g/L,初始pH7.4。
4.2.4生物反应器及其运行餅
生物反应器及其运行射牛:反应器的有效容积为30L,配备有两层搅拌桨,T/D=0.5, D=0.3m; 发酵液的溶氧浓度DO值采用原电池型溶氧电极插于两层搅拌桨之间自动检测;采用1%的
H2SO4溶液和1%的NaOH溶液自动控制调节发酵液的pH值;发酵温度26°C,转速800r/min, 通气比为1:1vvm,发酵周期90小时。
4.2.5分析施及原理
4.2.5.1发酵液粘度的测定用NDJ—1型旋转粘度计,室温,30rpm下测定。
4.2.52黄原胶浓度的测定工业乙醇(95%)沉淀出胶体,洗涤后70C真空干燥后称
重。
4.2.5.3发酵液中菌術农度的测定分光光度计650nm处测定O.D值。
42.5.4还原糖、淀粉浓度的测定 还原糖及淀粉浓度测定的原理 :
淀粉经酸或酶水解生成葡萄糖:
酸或酶
(C6Hi〇〇5)n + nH2〇^ nCaHi2〇a
所生成的葡萄糖用斐林试剂测定。
斐林试剂由甲、乙液组成。甲液为硫酸铜溶液,乙液为氢氧化钠与酒石酸钾钠溶液。平时 甲、乙液分别贮存,测定时甲、乙液等体积混合。混合时,硫酸铜与氢氧化钠反应,生成氢氧 化铜沉淀:
2NaOH + CuS〇4 = Cu(OH)2!+ Na2S〇4
所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钾钠反应,生成酒石酸钾钠铜络合物,使氢氧化铜溶解:
COOKCOOK
I
C H O
CHOH
+2 H2O
HO
Cu(OH)2+ I
CHOH
C O O N aCOONa
2
 
C u +
COONa
C
 
(C H O H 4)
I
C H 2 O H
+2 H 2 O
酒石酸钾钠铜络合物中二价铜是一个氧化剂,會巨使还原糖中羰基氧化,而二价铜被还原生 成—价的氧化亚铜沉淀:
COOK
CHOHC O O H
2| ++C U2〇
CHOH(C H O H)4
COONaC H 2〇 H
反应终点用次甲基蓝指示剂显示。因次甲基蓝氧化能力较二价铜弱,故待二价铜被还原后, 过量一滴还原糖马上使次甲基蓝还原,溶液蓝色消失以示终点。
具侧定方法:
a•斐林试剂的标定汲取斐林试剂甲、乙液各5毫升,置入250毫升三角瓶中,黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的研究,加入20毫升水, 并从滴定管中预先加入约24毫升0.2%标准葡萄糖溶液,摇匀,于电炉上加热至沸,并保持微沸 2分钟。加2滴1%次甲基蓝溶液,以4?5秒钟1滴的速度继续用0.2%标准葡萄糖溶液滴定至 蓝色消失。此滴定操作需在1分钟内完成,其消耗0.2%标准葡萄糖溶液应该控制在1毫升以内。
丙酮酸(%) =5x88400 (Ai- A2) 4.05 样品质量/Sw/6.22/1000 其中:5为稀释倍数,88为丙酮酸的分子量,3.05为溶液体积,Sw为黄原胶样品重量(mg), 6.22为还原型辅酶I(NADH)的毫摩尔吸光系数。
4.2.6反应器内部结构 4.2.6.1搅拌器的型式
 
Fig.4.1Structure and description of flow field of the new agitator
 
新型组合搅拌器和传统搅拌器的结构及其流场描述如图4.1和4.2所示:
图4.2传统搅拌器的结构及其流场描述 Fig.4.2 Structure and description of flow field of the conventional agitator
4.2.6.2挡板型式
采用全深型挡板,窄挡板宽度为20mm,宽挡板宽度为34mm。 4.3实验结果及讨论 4.3.1不同桨型组合对发酵的影响
30
4.3.1.1不同搅拌桨对发酵液黄原胶浓度的影响
(I曰02/3)48误铛晒瓶
 
 
50
发酵时间(h)
100
图4.3可见,新桨(以下称改进桨)体系下黄原胶稳定产胶期提前,整个发酵过程中黄原胶 浓度始终高于原桨(以下称传统桨)体系。改进桨的上层采用下压式双折叶圆盘涡轮、下层采 用六叶布鲁马金,两种桨都能在产生径向流的同时又能产生轴向流,尤其是布鲁马金属于剪切 循环兼顾型叶轮,黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的研究,适用于既需要一定剪切、又需要高循环的场合,而下压式双折叶圆盘涡轮在 产生很强剪切流的同时又能产生一定的轴向流,强化了混合效果,较好地满足了黄原胶发酵液 对较大流动循环量的需求,改善了反应器内部的传质混合效果。
图4.3发酵液中黄原胶浓度随时间的变化 Fig.4.3 Relationship between concentration of Xanthan gum in the broth and fermentation time
黄原胶属次生代谢产物,发酵动力学为菌株生长与产物合成非偶联类型,与抗生素和微生 物毒素等物质合成代谢类似,代谢产物的合成是在菌体浓度接近或达到最高后才开始的[29]。改 进桨体系下良好的传质混合效果缩短了菌体的增殖期,发酵液中黄原胶浓度的稳定增长期提前, 明显早于传统桨体系。黄原胶发酵过程初期表现为低粘度的牛顿体系,随着产物的形成和积累, 发酵液粘度渐增,在后期呈现为高粘度的假塑性非牛顿体系,限制了氧的传递和其他营养物质 的交换,影响黄原胶产量的进一步提高。78小时后发酵液中黄原胶浓度继续增加,改进桨体系 下黄原胶浓度的增长幅度高于传统桨。改进桨组合较好的气液分散效果,较高的气含率,较大 的传质系数,气体在罐内较长的停留时间,在一定程度上克服了发酵后期存在的上述问题。
在任何微生物发酵过程中,根据生物反应动力学原理,当发酵液中的底物下降到一定浓度 时,菌体代谢速率非常缓慢,在工业生产中可以结束发酵。本研究中黄原胶发酵结束时改进桨 体系与传统桨体系发酵液中的残糖含量基本相同,均下降到0.5%以下。但是,对照图4.3可以 看出,改进桨体系下发酵液中的黄原胶浓度明显的高于传统桨体系,那么合成这部分黄原胶的 底物葡萄糖来自于明哩?对照图4.5可以看出,改进桨体系下发酵液中残留淀粉浓度始终低于传 统桨体系,直到发酵结束。这是由于改进桨良好的混合传质效果,强化了胞外淀粉酶与底物淀 粉的充分接触,有利于淀粉的快速水解,也就是说,改进桨体系条件下多合成的这部分黄原胶 所需要的葡萄糖正是来自于良好的淀粉水解。培养基中的淀粉最大程度的水解为合成黄原胶所 需要的葡萄糖,既有利于黄原胶产率的提高,又有利于黄原胶的提取。
4.3.1.4不同桨型组合对于发酵液混合的影响
在黄原胶的生物发酵过程中,由于黄原胶具有高粘度的特性,不但导致了其发酵中后期粘 度过大,给发酵过程中氧的传递、气液混合以及热量的传递等带来了很大的困难[30],而且在靠 近反应器内壁处还存在一个基本上静止不动的发酵液区域,在此区域内,氧和其他营养物质的 传递、交换更为困难,导致了细胞活力的下降甚至细胞死亡。研究表明,发酵结束后,无论是 在改进桨体系下还是在传统桨体系下,运动区与静止区的发酵液中黄原胶浓度、粘度、残糖浓 度等各项参数都有着明显的差异,见表4.1。
33
表1数据表明,无论是在改进桨体系下还是在传统桨体系下,发酵中后期均有发酵液静止区 出现,而且其体积均随发酵的进行而增大;运动区发酵液中黄原胶浓度、粘度、丙酮酸的含量 始终高于静止区,而葡萄糖含量和淀粉含量则低于静止区,运动区黄原胶的综合指标明显高于 静止区。
 
60小时78小时
表4.1运动区和静止区发酵液中各项参数的差异 Table 4.1 Difference of parameters between motive area broth and still area broth
 
葡萄糖浓度(g/100ml)0.396
淀粉浓度(g/100ml)1.371
氮源浓度(g/100ml)0.1557
丙酮酸含量(g/100ml)2.371
0.41
1.543
0.1376
1.981
0.48
1.188
0.2293
2.373
0.52
1.268
0.2068
2.01
传统搅拌器组合
新型搅拌器组合
图4.7两种搅拌器在发酵后期产生相对静止区范围的比较 Fig.4.7 Comparison of the comparative still area of the two agitators in later fermentation period
搅拌操作时,用搅拌器对低粘度互溶液造成湍流并不困难,但粘度达到较高水平后,由于 粘滞力的影响,就只能出现层流状态。尤其困难的是,这种层流也只能出现在搅拌器附近,离
34
桨叶稍远些地方的高粘度液体仍是静止的。这样就很难造成液体在搅拌设备内的循环流动,即 在设备内会有死区存在,对混合、分散、传热、反应等各种搅拌过程十分不利。所以高粘度液 体搅拌的首要问题就是要解决流体流动与循环的问题,设法使搅拌器推动更大范围的液体[31]。 如图4.7所示,改进桨体系由于较大的轴向循环量推动了更大范围的液体,促进了反应器内部的 总体混合,其静止区明显减少。if价任何生物反应过程,其最终的产率或者底物一产物转化率 都是一个重要指标,甚至是决定性指标。如上所述改进桨能提高黄原胶发酵液的浓度,必然增 加了黄原胶的糖胶转化率,同时又由于其静止区的体积减少,也带来了黄原胶产率的增加,并 且提高了高质量黄原胶的含量。因此可以说这种桨型组合应用于黄原胶等高粘性物系的发酵, 在一定程度上能够克服发酵后期粘度过高而带来的氧和其他营养物质的传递、交换困难的难题, 黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的研究,适合于高粘性物系的发酵。
4.3.2档板尺寸对发酵过程的影响 4.3.2.1档板对菌体生长的影响
 
图4.8 XG-101菌株生长曲线
Fig.4.8 the growth curve of XG-101
黄原胶发酵过程中发酵液的吸光度光度值随时间不断变化,发酵液吸光度的变化可以看作 是其中菌体量的变化,故吸光度随时间的变化曲线可以看作是菌体的生长曲线,体现发酵过程 中菌体的生长情况[32]。图4.8可见,原挡板条件下,菌体生长曲线随发酵时间不断上升,没有明 显的对数生长期和稳定期;无挡板和窄挡板条件下,菌体生长曲线符合正态分布,与微生物的 典型生长曲线完全相符。挡板的设置有利于增加流体的湍动效果,同时也对流体产生了相当大 的剪切力。原挡板条件下发酵液受到的剪切力相对于无挡板条件和窄挡板条件要大,而黄单胞
35
杆菌作为一种较为脆弱的菌体,生长初期对环境的剪切作用非常敏感,因此原挡板条件下菌体 的生长情况明显差于无挡板条件和窄挡板条件。
黄原胶属次生代谢产物,其发酵动力学为菌株生长与产物合成非偶联类型,代谢产物的合 成是在菌術农度接近或达到最高后才开始的[33]。为获得高产,培养条件要求短的对数生长期和 长的稳定期,或降低对数生长期的生长率,已提早形成次级代谢产物,原挡板条件不利于黄原 胶产物的获得。
4.3.2.2档板对发酵的影响
上述各项数据表明:对于黄原胶发酵,在改进桨体系下,窄挡板和无挡板条件下发酵液中 黄原胶浓度和粘度明显高于原挡板条件;发酵结束时窄挡板和无挡板条件下葡萄糖含量和淀粉 含量亦明显低于原挡板条件。对于窄挡板和无挡板这两种状态,无挡板条件下发酵液静止区的 体积小于窄挡板条件,并且发酵液静止区体积的大小与挡板宽度之间还存在着正相关的关系, 挡板越宽,其静止区体积越大。
通常,对于低粘度物系,为了消除搅拌容器内液体的打旋现象,使被搅物料能够上下轴向 流动,需要在搅拌容器内加入若干块挡板。安装在筒体内壁的挡板可把回转的切向流动改变为 径向和轴向流,较大地增加了流体的剪切强度,增大湍动程度,改善主体循环,促进全釜的均 匀混合;同时还能降低搅拌载荷的波动,使功率消耗保持稳定。但是,许多研究表明,当物料 的粘度增加时,挡板的宽度可相应的减少,当粘度达到1〇Pa* S时,可以不再按装挡板[34]。对于 黄原胶这种高粘性物系,在发酵初期,由于没有黄原胶产生或产生的量很少,发酵液的粘度较 低,搅拌器很容易在全罐内形成湍流,从而达到全罐的混合。黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的研究,但是随着发酵的进行,黄原胶浓 度不断增大,发酵液变得越来越粘稠,搅拌器的工作状态逐渐由湍流域转变为过渡流域或层流 域,这时仅叶轮周围的液体随叶轮旋转。由于粘滞力的影响,随着离搅拌器距离的增加,流体 速度下降得越来越明显,此时罐壁处的发酵液流速更小。当在罐壁处加装挡板后,以较低速度 运动的发酵液迅速在挡板前后形成停滞区域,此时挡板的存在严重影响了全罐的混合,这对黄 原胶的发酵生产是十分不利的。因此,缩小挡板宽度或将挡板拆除后,相对于原有挡板条件下 发酵液更容易形成规整的循环流,有利于整个发酵液的均匀混合,适合于黄原胶这种高粘性物
38 
系的发酵。这一研究结果,与李卫旗,姚恕[35]研究的在传统平叶搅拌器发酵设备中适当减小挡 板数目或不设挡板更有利于黄原胶高粘性物系发酵的研究结果一致。
4.4小结
本章在最佳发酵工艺条件下,针对新的桨型组合对发酵过程的影响、挡板对发酵过程的影 响进行了研究。研究结果表明,新的桨型组合在保持好的径向气体分散能力的同时,加强了轴 向循环混合的能力,明显改善了反应器内部混合状态,具有以下明显的优点:
⑴新型桨组合较大的流动循环量、优良的传质混合效果缩短了黄原胶进入稳定产胶期所需的 时间。
⑵新型桨组合提高了整个发酵过程黄原胶的浓度,提高了发酵液的粘度,
(3)改进桨组合较高的传质系数、较好的宏观稳定流型提高了碳源的利用率,减少了最终发酵 液中淀粉的残留量,降低了后提取工艺的难度与能源消耗。
⑷新型桨组合较强的搅拌混合效果降低了静止区的厚度,促进了氧的传递,增强了营养物质 的交换,提高了发酵液中黄原胶的浓度和质量。
对于黄原胶发酵体系,采用窄挡板或无挡板的釜内结构形式有利于物料混合,提高发酵过 程效率。
39
五、结论与廳 5.1结论
⑴黄原胶发酵过程由菌体的生长代谢阶段和产物的合成阶段组成;黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的研究,XG-101黄单胞杆菌发酵 生产黄原胶的最佳培养基配方:淀粉〇.4g/L,豆粉0.06g/L,碳酸钙0.02g/L;a _淀粉酶活力 20000UM时,用量0.25U/淀粉,液化2分钟时发酵液中黄原胶的浓度最高;最佳发酵条件:温 度26°C、通风比为1: 1 vvm、搅拌转速800r/min。
⑵下压式双折叶圆盘涡轮与六叶布鲁金桨组合在具有较高气含率及容积氧传质系数的同时功 耗较低,具有较好的搅拌混合效果,有利于解决黄原胶发酵后期粘度过高所弓丨起的传质混合困 难等问题。
(3)采用下压式双折叶圆盘涡轮与六叶布鲁金桨组合,缩小挡板尺寸或拆除挡板,可以在保持 好的径向气体分散能力的同时,力口强了轴向循环混合的能力,明显改善了反应器内部混合状态, 缩短了黄原胶进入稳定产胶期所需的时间、提高了发酵液中黄原胶的浓度和质量以及发酵液的 粘度、减少了最终发酵液中淀粉的残留量,降低了后提取工艺的难度与能源消耗。
本文推荐企业:澳门威利斯人88038(http://www.sdcmcchina.com/),是专业的澳门威利斯人88038,羧甲基淀粉钠,黄原胶生产型企业,专业生产澳门威利斯人88038,羧甲基淀粉钠,黄原胶。拥有雄厚的技术力量,先进的生产工艺和设备。东达纤维素有限企业全体员工为海内外用户提供高技术,高性能,高质量的产品。热忱欢迎国内外广大客户合作共赢。
 
XML 地图 | Sitemap 地图