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溶菌酶与羧甲基纤维素层层自组装的省略印迹聚合物及医用材料表面修饰

发布日期:2014-12-15 10:36:37
溶菌酶与羧甲基纤维素层层自组装的省略印迹聚合物及医用材料表面修饰研究
溶菌酶与羧甲基纤维素层层自组装的省略印迹聚合物及医用材料表面修饰
溶菌酶与羧甲基纤维素层层自组装的省略印迹聚合物及医用材料表面修饰,层层自组装技术工艺简单,厚度可控,制备条件温和,可实现多种生物分子 的表面固定,并有利于生物分子维持生物活性和天然构象,适用于具有复杂体型 结构的材料,已成为生物医用材料表面功能设计的有效手段之一。而许多天然生 物大分子都带有电荷,也为采用静电层层自组装技术构建复杂的多层膜结构提供 了方便。因此本工作采用层层自组装技术,利用羧甲基纤维素与溶菌酶来制备溶 菌酶分子印迹聚合物以及进行聚氨酯医用材料表面修饰研究。
本工作首先采用分子印迹技术与层层自组装技术相结合的方法,利用羧甲基 纤维素与溶菌酶制备溶菌酶分子印迹聚合物。通过层层自组装的方法将带正电荷 的溶菌酶和带负电荷的羧甲基纤维素固定在羧甲基纤维素基材表面,再经氯化铁 交联后,采用氯化钠溶液洗脱模板蛋白质,制备出羧甲基纤维素的层层自组装溶 菌酶分子印迹聚合物。通过水接触角测试、扫描电镜及蛋白质吸附测试等对蛋白 质印迹聚合物进行了分析。测试结果表明,与非印迹聚合物相比,溶菌酶印迹聚 合物表面变粗糙,并且出现了一些微孔结构;该印迹聚合物对模板蛋白的吸附能 力与非印迹聚合物相比提高了 50%;该印迹聚合物对于模板蛋白质具有特异选择 性吸附效果;并且该印迹聚合物具有可重复利用性。
其次,采用层层自组装技术,利用羧甲基纤维素与溶菌酶对聚氨酯基材进行 表面层层自组装改性。对聚氨酯基材表面进行氨基化改性,然后通过层层自组装 的方法将带负电荷的羧甲基纤维素和带正电荷的溶菌酶固定在官能化后的聚氨 酯基材表面。通过原子力显微镜、抗菌活性测试、溶血率试验等对层层自组装改 性前后聚氨酯材料进行表征。测试结果表明,与未改性聚氨酯膜片相比,改性后 聚氨酯膜片表面纳米级别凹凸结构增加;与未改性材料相比,改性后聚氨酯材料 对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为45.5%和41.4%;经过表面层层自 组装改性后,聚氨酯材料溶血率由1.38%减少为0.38%。
本工作采用层层自组装方法,利用羧甲基纤维素与溶菌酶进行了溶菌酶印迹 聚合物和聚氨酯医用材料表面修饰的研究,该研究为蛋白质选择性吸附分离研究 和医用材料表面修饰研究提供了新的思路和方法。
第一章绪论
1.1生物医用高分子材料
生物医用材料是用来对生物体进行诊断、治疗、修复或替换其病损组织、器 官,或增进其功能的材料。生物医用材料按照材料的组成和性质可以分为生物医 用金属材料、生物医用无机非金属材料(生物陶瓷)、生物医用高分子材料、生 物医用复合材料和生物衍生材料(生物再生材料)[1]。
生物医用高分子材料,顾名思义,是和医学、生物学发展有关的高分子材料 的总称 ,生物医用高分子材料是生物医用材料中发展最早、应用最广泛、用量 最大的材料,是一个正在迅速发展的领域[1]。
1.1.1生物医用高分子材料特性
现代医学的发展,对材料的性能提出了越来越高的要求,这是大多数金属材 料和无机材料难以满足的,而合成高分子材料与生物体(天然高分子材料)有着 极其相似的化学结构,而且其来源丰富,能够长期保存、品种繁多、性能可变化、 范围广,如从坚硬的骨头和牙齿、强韧的指甲,到柔软而有弹性的肌肉组织、透 明的角膜等都可以用高分子材料制作,而且其可加工成各种形状复杂的形状,因 此生物医用高分子材料在生物医用材料领域占绝对优势。目前,利用生物医用高 分子材料制作的各种医疗装置,如植入型全人工心脏、肾、肝、胰、膀胱、皮、 骨、角膜、接触镜、晶体、心脏瓣膜、内外耳修复、各种尺寸的血管以及缝线等 都获得了临床应用[2]。
1.1.2生物医用高分子材料分类
目前生物医用高分子材料根据材料来源,可分为天然生物医用高分子材料和 合成生物医用高分子材料,根据其稳定性可分为不可降解型生物医用高分子材料 和生物降解型医用高分子材料,根据其应用,可分为固定、缝合材料,人工脏器、 药用高分子材料、血液净化高分子材料及诊断用高分子材料。
1.1.2.1非生物降解型医用高分子材料
非生物降解型高分子医用材料主要包括聚氨酯、聚丙烯酸酯、硅橡胶等,广 泛用于肌腱、韧带、血管、皮肤、人工脏器、牙齿和骨等人体软、硬组织及器官 的修复和制造以及黏合剂、人工晶体、材料涂层等。其特点是大多数不具有生物
活性,与组织不易牢固结合,易导致过敏性、致毒性等反应。
聚氨酯具有出色的物理机械性能和良好的生物相容性,对人体具有良好的生 理可接受性,并可以保持人体植入的长期稳定性[3]。聚氨酯全称为聚氨基甲酸酯, 是主链上含有重复氨基甲酸酯基团的大分子化合物的统称。聚氨酯由多元醇、小 分子扩链剂与异氰酸酯共聚而成,其分子链包括软段和硬段,软段由多元醇(聚 醚、聚酯等)构成,硬段由异氰酸酯和小分子扩链剂(二胺或二醇)构成,通过 改变软硬段的结构、分布、相对比例及改变相对分子质量等方式,可以大幅度地 改变聚氨酯的性能。与其他生物医用材料相比,聚氨酯的一个主要结构特征是微 相分离结构,由于硬段的极性强,相互间吸引力大,容易聚集在一起形成许多微 区,这样硬段和软段在热力学上具有自发分离倾向,硬段的微区分布于软段相中, 从而产生微相分离。这种微相分离表面结构与生物膜很相似,由于存在着不同表 面自由能分布状态,改进了材料对血清蛋白的吸附能力,抑制了血小板在材料表 面的粘附,减少了血栓的形成,因此聚氨酯具有良好的血液相容性和生物相容性, 加上聚氨酯优异的物理机械性能,且分子设计可控性强,因此聚氨酯作为生物医 用材料很早就收到人们的重视[4]。
聚甲基丙烯酸酯俗称“有机玻璃”,由于具有良好的生物学性能,包括良好 的生物相容性、骨结合性和生物学惰性,即植入人体后与天然骨之间不发生反应, 以及良好的物理机械性能,包括良好的机械强度、良好的透明性,在湿态下柔软、 富有弹性、透气性好等[5],可被用于作为骨缺损修复材料[6]和软接触镜片材料[7]。
1.1.2.2生物降解型医用高分子材料
生物降解型医用高分子材料在体内一段时间能够充分发挥其功能,一段时间 后开始降解并且失去其原有的功能,其降解的产物经过新陈代谢后被人体吸取或 被排出体外。由于生物降解型医用高分子材料不需要二次实施外科手术将其取 出,因此在需要临时性存在的植入治疗中有广阔的应用前景。主要应用在外科手 术隔离材料、手术缝合线、人造血管、人造皮肤、骨固定及修复和药物控制释放 等领域
生物降解型高分子根据来源可分为天然和人工合成两类,合成生物降解型高 分子的代表为聚酸酐、脂肪族聚酯等。天然可降解型高分子来自于动植物或人体 内天然存在的高分子,例如纤维素、壳聚糖等天然生物多糖,蛋白质、酶等天然 高分子等。天然高分子都具有良好的生物相容性,无毒,且降解产物可随新陈代 谢被人体吸取或排除体外。
纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种生物多糖,是取之不尽用之不 竭的天然高分子,人类最宝贵的天然可再生资源。纤维素的分子式(C6H1()O5)„, 2
是由D-葡萄糖以P-1, 4糖苷键组成的大分子多糖,分子量50000?2500000, 相当于300?15000个葡萄糖基,是植物细胞壁的主要成分。纤维素结构式如图 1-1 所示[11]。
 
纤维素结构单元上的3个醇羟基可以发生各种酯化、磺化和醚化反应[12], 因而可以制造出多种纤维素衍生物,在很大程度上改变纤维素的性质,常见的纤 维素衍生物包括硝酸纤维素、醋酸纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤 维素和羧甲基纤维素。纤维素衍生物材料可用于制备药物缓释系统[13]和制造各 种医用膜[14]。
羧甲基纤维素是纤维素和一氯醋酸钠经醚化作用制成的,是以羧甲基钠 (-CH2COONa)取代纤维素葡萄糖基环上羟基(-OH)的氢而生成的一种纤维 素醚,简称CMC,羧甲基纤维素通常以钠盐形式存在,通常所说的CMC是指 澳门威利斯人88038。CMC具有良好的成膜性,良好的生物相容性,常被用作防粘 连材料和止血材料。孙康[15]等对半流体CMC椎板切除后硬膜粘连的预防效果进 行了研究,动物实验表明CMC作为三维屏蔽材料既能包绕神经根又可保护硬膜, 能够有效防止硬膜粘连。李有柱[16]等人利用Fe3+改性CMC,改性后的CMC能 有效防止或减轻术后的腹膜粘连,而且不会影响创口和创面的愈合。目前临床上 使用的可溶性止血纱布的主要成分就是CMC[17],止血过程通过物理止血和生理 止血协同作用来实现[18],当接触血液时,CMC吸取血液中的水分而溶胀成胶状 体,使血液粘度变大,流速减慢[19],形成的粘性体能够填补创面的空隙,从而 使毛细血管封闭,达到止血的目的[2G]。同时CMC可与血液中的Fe2+形成不溶性 覆盖物或填充物从而使创面止血[21]。另外,溶解的CMC还可释放出负离子,能 活化血液中的凝血因子,凝集血小板,起到凝血的作用,达到止血的目的。可溶 性止血纱布最终在人体内降解为单糖被人体吸取[22]。
甲壳素是另一种重要的天然生物多糖,甲壳素的化学名称是(1,4) -2-乙酰 胺基-2-脱氧-P-D-葡聚糖[23],甲壳素具有良好的成膜性,分子链上含有羟基和氨 基,可经过化学修饰对其改性。值得注意的是甲壳素具有优良的生物性能,首先, 甲壳素及其衍生物是无毒副作用的天然高分子,因此具有良好的生物相容性;其 次,甲壳素具有优异的生物活性,其制品具有抗菌、降低血清和胆固醇含量、抑 制成纤维肿瘤细胞以及促进上皮细胞生长,促进体液免疫和细胞免疫等作用;再 次,甲壳素生物降解性好,且降解产物无毒能被人体吸取[24]。甲壳素作为生物 医用材料的应用包括制备人工皮肤、可吸取缝线[25],另外甲壳素有望在生物降 解支架材料[26]以及药物缓释材料P7]领域发挥作用。
蛋白质也是一种重要的生物医用高分子,在生物体内发挥着重要的作用。胶 原蛋白是一种动物体内含量丰富的蛋白质,在动物细胞中扮演结合组织的角色。 为生物科技产业最具关键性的原材料之一,也是需求量十分庞大的最佳生物医用 材料。其应用领域包括生物医用材料、化妆品、食品工业、研究用途等。胶原蛋 白具有良好的生物性能,在人工皮肤[28]、骨组织[29]和软骨组织[3()]领域应用较广 泛。
酶也被称为“酵素”,指由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂,生物体 内的化学变化几乎都是在酶的催化作用下进行,酶的作用具有高度专一性,而且 效率很高,一个酶分子在一分钟内能催化数百至数百万个“底物”分子的转化。 酶在医疗保健方面的应用,可以分为两部分:一是治疗,二是诊断。酶可用于制 备医药制剂,由于酶制剂具有作用明确、专一性强、疗效好等优点而被广泛用作 抗炎清疮、助消化、促纤溶、促凝、抗肿瘤、促进生物氧化以及解毒等方面的治 疗用药[3|]。酶传感器是利用电化学装置检测酶反应中生成或消耗的物质(电极 活化物质),将其转变为电信号,通过电信号来计算与酶反应有关的各种物质的 浓度。酶传感器的主要应用是诊断疾病时检查血液和尿液,废水成分分析和食品 成分分析等[32]。
1.1.3生物医用高分子表面修饰技术
医用高分子材料是生物医用材料的一个重要组成部分,是一类用于诊断、治 疗和器官再生的高分子材料,具有延长病人生命、提高病人生存质量的作用。
生物相容性是材料用于生物医用目的时所要具备的重要性质。植入体内的器 件需符合组织相容性、血液相容性的要求,用于体外场合的许多制件也要求一定 的生物相容性。材料的生物相容性不仅受其本体性质的影响,而且在很大程度上 取决于材料表面的物理和化学性质,因此为提高生物材料的生物相容性,常常对 材料或制件表面进行改性使之满足医学临床的需要。
1.1.3.1医用高分子材料常用表面修饰技术
材料表面改性是指在不改变材料及其制品本体性能的前提下,赋予其表面新 的性能或功能。通过材料表面的改性可提高材料表面的亲水性、耐老化性、耐磨
性和生物相容性等。生物医用材料常用的改性方法有:材料表面接枝改性、等 离子表面改性、离子束表面改性技术、材料表面生物化(包括材料表面单分子自 组装修饰及材料表面层层自组装修饰等)。
材料表面接枝改性是表面改性的重要方法之一,包括化学接枝法和物理接枝 法。
化学接枝方法是利用材料表面的反应基团与被接枝的单体或大分子链发生 化学反应而实现表面接枝,包括偶联接枝、自由基引发接枝和臭氧引发接枝。偶 联接枝是指待改性材料表面反应基团与接枝分子链上的活性基团形成共价键来 实现表面接枝。
物理接枝方法是通过射线产生聚合活性中心的接枝技术,主要包括辐射接枝 和光引发接枝。辐射接枝的辐射源包括Y射线、a射线、射线及X射线等高能 辐射,其中Y射线是最常用的辐射源。
等离子体是一种全部或部分电离的气态物质,含有亚稳态和激发态的原子、 分子、离子,并且电子、正离子、负离子的含量大致相等。等离子体中的电子、 离子、原子、分子等都具有一定能量,可与材料表面相互作用,是表面发生物理 化学变化而实现表面改性。等离子体表面改性包括三种类型:等离子体表面聚合、 等离子体表面处理与等离子体表面接枝。
离子注入技术应用于高分子生物材料表面改性始于80年代末。利用载能离子 轰击高分子材料表面,使表面化学键断裂,生成新的功能基团,从而使高分子材 料的表面极性、浸润性和表面能发生显著变化,从而提高其生物相容性。
自组装单分子层是对材料表面进行微观设计的新方法,由于能对自组装单分 子层分子基团的位置和种类进行控制,因此可以在分子水平上对材料表面进行改 性。将聚二甲基硅氧烷橡胶进行表面氧等离子体处理,在表面形成活性含氧基团, 然后在材料表面自组装三氯硅烷单分子层,通过改变三氯硅烷SiCl3 (CH2) nX中 基团X的种类还可以控制材料的各种表面生物性能,如血小板与纤维蛋白粘附 量、内皮细胞附着程度等1331。
层层自组装最先被Decher与他的同事们在1992年发明,他们制备了可用于生 物领域的结构可控的薄膜。许多物体的表面,例如金属、硅树脂、玻璃,在水溶 液中都带有负电荷,将这些带负电荷的表面浸入带正电荷的聚电解质溶液里,然 后用纯水洗掉表面吸附不牢的聚电解质,这样材料表面就带上了正电荷,再将材 料浸入带负电荷的聚电解质溶液里,这样材料表面所带电荷性质又变为负的,重 复以上步骤,就能得到在表面组装所需结构与厚度的多层膜,这已成为生物医用 材料表面功能设计的有效手段之-•[34?36]。而许多天然生物大分子都带有电荷, 也为采用经典的静电层层自组装技术构建复杂的多层膜结构提供了方便。
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Szyk等人研究了吸附或嵌入聚苯乙烯磺酸钠/聚烯丙胺盐酸盐多层膜中人血 清白蛋白的扩散行为。他们发现蛋白质的扩散系数与表面蛋白质浓度和最外层聚 电解质类型有关,但是不管蛋白质是在多层膜表面还是内部其横向移动都很大, 这就是为什么层层自组装多层膜能作为目标生物医用材料涂层的原因[37]。假体 移植术后最严峻的问题就是由于植入材料导致的细菌感染,透明质酸/壳聚糖多 层膜由于富含氢键并且氢键间存在强烈的亲水排斥作用,不仅可用于阻止细胞粘 附,也可用作抗菌涂层PS]。
1.1.3.2生物多糖用于生物医用材料表面修饰的研究
聚多糖是一个大家庭,它们的分子链由主链和侧链组成,主链由糖单元通过 糖苷键连接而成。聚多糖主要有两种类型,一种是存在与植物细胞体内的多糖, 主要代表为纤维素;另一种是存在于动物组织中的多糖,典型代表为糖原。聚多 糖在生物体内起着重要的作用。首先他们是动植物细胞结构的重要组成部分;其 次,聚多糖是细胞膜的组成部分(又被称为多糖包被);再次,聚多糖可以作为 细胞表面感受器;最后,由于聚多糖的高水合作用,他们具有良好的蛋白质排斥 性能。
由于生物多糖良好的物理、化学与生物学性能,将生物多糖用于表面修饰越 来越热门,利用生物多糖多层膜对生物材料进行表面改性可以有效提高材料表面 的生物性能。生物多糖作为一种天然成分,优于合成聚合物的方面是能通过体内 的酶自然地降解,这也是生物多糖被用于生物医用材料表面修饰的一大优势。已 有许多生物多糖被用來进行生物医用材料的表面修饰,例如氨基化透明质酸[39]、 季铵化壳聚糖羧甲基纤维素[41]、果胶[42透明质酸[43]、壳聚糖肝素[45] 与粘蛋白[46]。Nguyen[47]等人将肺表面活性物质、羧甲基纤维素与聚氧乙烯-聚氧 丙烯三嵌段共聚物接枝到一种可生物降解聚合物表面,改性后材料细胞相容性得 到提高。
1.2酶
1.2.1酶的概念
地球上到处都有生命,从宏观可见的参天大树到微观可见的细菌、病毒,从 天上飞的鸟到水中游的鱼,生物体种类繁多,形形色色,但是不管生物体如何多 种多样,凡是有生命的地方几乎都有酶,都需要酶,所有的生物体在一定条件下 都可以合成各种各样的酶,生物体内的各种生化反应几乎都是在酶的催化作用下
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进行,所以说酶既是生命活动的产物又是生命活动不可缺少的物质之一[48]。酶 (Enzyme),早期是指在酵母中的意思,指由生物体内活细胞产生的一种生物 催化剂,与其他的无机或有机催化剂相比,具有许多优点,如催化效率高、高度 专一性、温和的作用条件、酶反应容易控制、酶的来源广泛等。其化学组成主要 是蛋白质或核糖核酸(RNA),按其化学组成的不同,酶可分为两大类别,化 学组成主要为蛋白质的酶称为蛋白类酶,化学组成为RNA的酶称为核酸类酶(R- 酶)。
1.2.2酶在有机体内的重要性[49]
酶与生命活动密切相关,酶在生物体内大致的说具有四种功能:
(1)实行具体的生理活动。例如生物膜上的Na-K-ATP酶负担离子主动运 转;碳酸酐酶维持血液的正常酸碱平衡:神经稍上的乙酰胆碱脂酶促成神经冲动 的传导等。
(2)参与外来物质的转化、解毒等过程,起保卫作用。如通过二酚氧化酶 的作用可以解除酚类对生物的入侵。
(3)协同激素发挥效应。
(4)催化代谢反应。在机体内已经建立的各种代谢途径、形成的各种代谢 体系,都是酶催化进行的,其中最基本的包括两种代谢系统,即生命物质的复制 系统(主要是核酸与蛋白质的合成)和能量的形成转化系统(主要是ATP的合 成)。
如果代谢系统中某一环节上酶出现了异常,发生了破坏或缺失,会造成机体 病变。上述两种基本代谢系统为一切生物所必须,所以不论动物、植物还是大多 数微生物都具有与此相关的酶、酶系统和辅酶。如果说酶的催化、酶系统的组成 和分布保证了生命活动的正常进行,那么生物在长期的进化过程中,为适应各种 生理机能的需要,为适应外界条件千变万化,还形成了从酶的合成到酶的结构和 活性各种水平的调节机制。因此,酶不仅是高度专一性的特殊生物催化剂,而且 酶是生物机体所产生的,在机体内具有特殊的重要性,酶和生命活动密切相关, 没有酶就没有生命。
1.2.3溶菌酶
溶菌酶(Lysozyme)是由英国科学家Heming于1922年在人的唾液和眼泪中 首次发现的,因为其具有溶解细菌的作用,所以称其为溶菌酶。溶菌酶在自然界 中是普遍存在的,家禽、鸟类的蛋清和哺乳动物的眼泪、血液、尿液、唾液、鼻 涕、乳汁和组织细胞中都有溶菌酶,从木瓜、无花果和卷心菜等植物中也能分离
出溶菌酶,其中以蛋清中的含量最高。
溶菌酶纯品为白色、微黄或黄色的结晶体或不定型粉末,无异味,易溶于水, 遇碱易被破坏.不溶于乙醚,溶菌酶分子量为14KD左右,等电点为11.8左右,最 适温度为35°C,最适pH为4.0-6.5。
溶菌酶是一类蛋白质酶,一种由129个氨基酸构成的碱性球蛋白,分子形状 为椭圆形。它通过水解细菌细胞壁中的肽聚糖达到溶解细菌的作用,它能够降解 细胞壁中肽聚糖N-乙酰胞壁酸的C1与N-乙酰葡萄糖胺的C4之间形成的糖苷键。 溶菌酶的活性受到温度、pH以及其它外部环境的影响。
溶菌酶具有抗病毒和细菌的能力,溶壁微球菌提取的溶菌酶被用于治疗眼部 感染和肠胃病,药用溶菌酶已被正式批准生产,临床效果良好且安全[5<)],而且 溶菌酶还可以与苄青霉素结合成复盐,加强苄青霉素的抗菌作用[51]。另外由于 溶菌酶良好的抗菌消炎作用和生物相容性,也常被用于生物医用材料表面修饰, 用于制备药物缓释系统或以提高材料表面的抗菌活性和生物相容性。Mehr〇tra[52] 等人在琼脂糖凝胶上组装了聚乙烯醇/聚丙烯酸/溶菌酶层层自组装多层膜,该 LbL多层膜具有pH响应性,在适当pH条件下能释放出溶菌酶,而溶菌酶与大 脑神经因子具有相似的大小与等电点,通过该聚乙烯醇/聚丙烯酸/溶菌酶层层自 组装多层膜的释放行为的研究可以模拟聚乙烯醇/聚丙烯酸/大脑神经因子的释放 行为,而从组装在琼脂糖上的聚乙烯醇/聚丙烯酸/大脑神经因子释放出大脑因子 到脊椎受损点,有助于成年人的神经中枢系统的轴突在脊椎受伤后的再生。 Rudra[53]等人组装了聚(L-谷氨酸)/溶菌酶LbL多层膜在一种固体载体上,该聚 (L-谷氨酸)/溶菌酶LbL多层膜能抑制周围液体环境中微球菌杆菌的生长,该 多层膜有望用于食品防腐领域或植物器件的外层。
1.2.4酶的分离纯化
1.24.1酶分离纯化的基本原则[54]
酶纯化就是要将酶和杂质分离开来,或选择性地将酶从包含杂质的溶液中分 离出来,或者选择性地将杂质从酶溶液中移除出去。为了能成功地进行酶的分离 纯化,应该注意以下问题。
1、防止酶变形失效
防止酶的变性失活是酶分离纯化过程中非常重要的问题。一般而言,凡是可 以用于预防蛋白质变性失活的方法与措施都可以考虑用于酶的分离纯化。如下:
(1)除了少数例外,所有操作都必须在低温条件下进行,特别是在有机溶 剂存在的条件更应该谨慎。
(2)大多数酶在过酸或过碱的条件下都不稳定,因此应控制整个系统不要 过酸或过碱。
(3)酶和其他蛋白一样,容易在溶液表面或界面处形成薄膜而变形,因此 操作时应尽量避免在表面形成泡沫。
(4)重金属等能导致酶失效,有机溶剂能使酶变性,微生物污染以及蛋白 水解酶的存在都能使酶分解破坏,所有这些都应避免。
2、选择有效的纯化方法
理论上,凡用于蛋白质分离纯化的方法都适用于酶,但是实际上,溶菌酶与羧甲基纤维素层层自组装的省略印迹聚合物及医用材料表面修饰,酶的分离 纯化还有更大的选择余地。
(1)酶纯化的最终目的使要将酶以外的一切杂质尽量除去,因此,可以在 不破坏待纯化的“目的酶”的范围内适用各种“激烈”的手段。
(3)由于酶和它作用的底物、它的抑制剂等具有高的亲和性,因此可以利 用各种亲和分离色谱法;而且,当这些物质存在时,酶的理化性质和稳定性往往 朝着有利的方向发展,这样又扩大了纯化方法与纯化条件的选择范围。
3、酶活性测定贯穿纯化过程始终。
1.2.4.2常见酶分离纯化方法
现有纯化方法都是以酶与杂蛋白在稳定性、理化性质上的差异以及酶的生物 特性为依据建立起来的,例如根据酶在不同溶液中的溶解度的不同来进行分离的 等电点沉降法、盐析法、有机溶剂沉淀法、双水相萃取法等,依据分子大小进行 分离的凝胶过滤层析、透析、超滤和离心,依据酶的电荷不同的电泳法和离子交 换层析,依据分子等电点进行分离的等电聚焦、依据分子带电性质进行分离的离 子交换色谱,依据酶和底物、辅助因子以及抑制剂间具有专一的亲和作用特点而 建立的各种亲和分离法等。
1.2.4.3分子印迹技术用于生物大分子分离纯化
分子印迹技术来源于免疫学的发展,早在20世纪40年代,著名的诺贝尔奖获 得者Pauling就提出了以抗原为模板来合成抗体的理论[55],为分子印迹的发展奠 定了一定的理论基础。
分子印迹技术是指为获得在空间结构和结合位点上与某一分子(模板分子) 完全匹配的聚合物的实验制备技术。它是通过以下方法实现的:(1)首先以具有 适当功能基的功能单体与模板分子结合形成单体-模板分子复合物;(2)选择适当 的交联剂将功能单体互相交联起来形成共聚合物,从而使功能单体上的功能基在 空间排列和空间定向上固定下来;(3)通过一定的方法把模板分子脱去。这样就
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在高分子共聚物中留下一个与模板分子在空间结构上完全匹配,并含有与模板分 子专一结合的功能基的三维空穴。这个三维空穴可以选择性地重新与模板分子结 合,即对模板分子具有专一性识别作用[56]。分子印迹聚合物制备过程示意图如 图1-2所示。
 
图1-2分子印迹示意图[56]
近几十年来生化分离技术有了飞速的发展,人们根据不同的原理开发出了很 多新型的分离技术,如根据分子大小进行分离的凝胶过滤层析和SDS-PAGE电 泳,根据分子等电点进行分离的等电聚焦电泳,根据分子带电性质进行分离的离 子交换色谱,根据分子疏水性质进行分离的疏水色谱和反相色谱,根据生物分子 亲和性进行分离的亲和分离技术等等。其中生物亲和分离的特异性最好,但由于 生物亲和物质的发现和分离十分困难,人们一直希翼能够人工合成具有类似生物 分子亲和识别能力的介质,而根据分子的大小、空间结构和电荷分布进行分离的 分子印迹技术使得这一希翼很可能得到实现。On [57]等人利用甲基丙烯酸、2-(甲 胺基)甲基丙烯酸乙酯与聚丙烯酰胺的复合体系来制备溶菌酶印迹聚合物,结果 表明大概有27%溶菌酶分子不能从聚丙烯酰胺凝胶里洗脱出来,在加入甲基丙烯 酸后能冼脱出更多的溶菌酶,与非印迹聚合物相比,印迹聚合物对溶菌酶的吸附 能力提高了 83%。Himyama[58]等人在二氧化硅粒子表面制备了溶菌酶的印迹聚 合物层,该印迹聚合物对溶菌酶具有良好的可重复使用稳定性与高的吸附选择 性。
目前虽然在生物大分子印迹技术上已经有了许多成果,但是仍然存在一些问
题:(1)目前有关生物大分子印迹方面机理的研究还相对肤浅;(2)由于生物大分子
体积都比较庞大,因而寻找一些新的功能单体、交联剂和印迹方式也是生物大分
子印迹中面临的一个挑战;(3)由于生物大分子印迹应用较多的是利用非共价键
作用,在非共价作用时,乙腈、氯仿等有机溶剂有利于氢键和离子键的形成和加
强,但酶、蛋白质等在有机溶剂中会有变性的可能,而在水中则由于水的极性较
强,会导致这种非共价作用变弱。这一矛盾也成为阻碍分子印迹在生物大分子上
应用的难题之一;(4)寻找一种温和有效洗脱蛋白质和酶的手段也是一个有待解
决的课题。如果洗脱后的蛋白质和酶失活无法回收利用,这就无形中增加了成本,
10
对以后酶和蛋白质印迹聚合物的大规彳旲应用造成了 一疋的阻碍。
1.3层层自组装技术 1.3.1层层自组装技术概念
 
 
 
1991年,0沈11^等[59]首次利用线型的阴、阳离子聚电解质通过静电自组装 的方法成功制备了多层复合平板膜,这之后层-层自组装技术广为人们接受,并 在近二十年内得到快速发展。所谓层-层自组装(Layer-by-layer assembly, LbL), 即利用逐层交替沉积的方法,借助各层分子间的弱相互作用(如静电引力、氢键作 用、配位作用等),使层与层自发地缔合形成结构完整、性能稳定、具有某种特 定功能的分子聚集体或超分子结构的过程[61]。静电层层自组装示意图如图1-3所 示。图1-3A为自组装多层膜的形成过程,步骤1和步骤3代表对聚电解质的吸 附过程,步骤2和步骤4代表清洗过程。这4个过程是构筑自组装多层膜的基本 步骤。重复以上4个步骤即可达到理想层数的多层膜。图1-3B代表首次吸附聚 阳离子与聚阴离子的简化图,图中基材表面的原始电荷是电负性的。
图1-3层层自组装示意图[6()]
层层自组装具有许多优点,如对成膜基质选择范围广泛,从金属小分子材料 到生物大分子材料都可以进行层层自组装,操作方便,条件温和,成膜驱动力的 选择较多,制备的薄膜具有良好的物理和化学稳定性,薄膜的厚度可控等等。
1.3.2层层自组装技术用于生物医用高分子表面修饰
层层自组装由于其操作简单,适用范围广泛,条件温和,可在水溶液中进行, 可保持生物大分子的天然构象和生物活性,且其组装的层数和厚度可控,因此成 为生物医用材料表面修饰的--种有效手段。另外许多天然生物分子在水溶液中带
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有电荷,这更为层层自组装技术用于生物医用材料表面修饰提供了便利。目前层 层自组装在生物医用材料领域的应用包括以下方面:生体模仿学、生物传感器、 药物释放、蛋白质与细胞粘附、细胞功能的调解以及可移植材料。Chung [62]等人 研究了聚烯丙胺盐酸盐/聚丙烯酸多层膜的装载能力与释放行为,将亚甲蓝作为 指示剂。在PH2.5/2.5条件下组装的聚丙烯酸/聚烯丙胺盐酸盐多层膜能够将亚甲 蓝装载在多层膜的里层,是因为聚丙烯酸上的羧基能吸附亚甲蓝,以及该多层膜 具有渗透性能。多层膜的释放行为依赖于环境的pH,酸性环境有助于提高释放 速率。在酸性环境下,聚丙烯酸上的羧酸根离子变成羧酸基团,因此羧酸根离子 与亚甲蓝之间的相互作用被破坏,导致亚甲蓝释放出来。Boura等人[63]研究发现 组装了聚苯乙烯磺酸钠/聚烯丙胺盐酸盐或聚(L-谷氨酸)/聚D-赖氨酸多层膜的 表面对人脐静脉内皮细胞(Huvec)的附着能力提高。与组装了聚D-赖氨酸或聚烯 丙胺盐酸盐单分子层的表面相比,多层膜显著增加了初期细胞的粘附能力。 Try〇en-T〇th[64]等人系统地研究了在聚乙烯亚胺-(聚苯乙烯磺酸钠/聚烯丙胺盐酸 盐)2,聚乙烯亚胺-(聚苯乙烯磺酸钠/聚乙烯亚胺)2多层膜表面成骨细胞与人牙周 韧带细胞的生存能力、粘附与骨显型性能。与玻璃或塑料表面相比,聚烯丙胺盐 酸盐、聚谷氨酸、聚(L-赖氨酸)为最外层的表面对两种细胞都粘附的较多,而 聚苯乙烯磺酸钠与聚乙烯亚胺表面粘附的两种细胞都较少。研究结果表明以聚苯 乙烯磺酸钠、聚谷氨酸为最外层的膜对牙周细胞具有良好的生物相容性,而最外 层为聚苯乙烯磺酸钠、聚谷氨酸、聚(L-赖氨酸)的膜对成骨细胞具有良好的生 物相容性。丁1^〇7[65]等人在植入支架表面构筑了透明质酸/壳聚糖多层膜,支架 已经被用于心血管外科,他们被插入堵住的动脉,阻止了小范围内的动脉压缩。
1.3.3层层自组装技术应用于分子印迹聚合物的制备
将层层自组装多层膜进行共价交联后得到了稳定的多层膜,该多层膜可以用 于制备分子印迹膜。该方法能在坚固的多层膜上产生印迹位点,并且可以随着 LbL多层膜的溶胀与收缩对模板分子进行释放与吸附,该印迹方法与传统印迹方 法相比能较快的吸附与释放模板分子。Shi[66]等人将层层自组装技术与层间结构 光化学交联技术相结合制备了印迹聚合物膜,该印迹膜具有稳定的印迹位点,在 光交联之后,该印迹膜显示出良好的可重复使用稳定性,并且能快速地吸附与洗 脱模板分子,该印迹膜对模板分子具有高的吸附选择性。〇&11(^11也丨[67]等人以茶 碱分子为模板,在二氧化硅纳米粒子表面进行了模板分子与聚丙烯酸的层层自组 装,并且通过聚丙烯酸的光交联使自组装多层膜形成交联体系,在洗脱模板分子 后得到了 LbL多层膜印迹聚合物,该印迹聚合物对模板分子具有很好的吸附选择 性。
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值得-•提的是,层层自组装技术由于其制备条件温和,可在常温水溶液中进 行,可以有效保持生物分子具有维持生物活性的天然构象,因此结合了层层自组 装技术的表面印迹法将解决蛋白质印迹技术存在的一些难题,例如蛋白质和酶分 子在有机溶剂里容易变形失活,生物大分子由于体积较大难以洗脱等。徐敏[68] 等人将带负电荷的牛血清白蛋白和带正电荷的壳聚糖交替吸附在交联壳聚糖基 材表面,再经环氧氯丙烷交联后,采用5%SDS-2% HAc溶液洗脱模板蛋白质, 制备出壳聚糖的层层自组装蛋白质分子印迹聚合物。溶菌酶与羧甲基纤维素层层自组装的省略印迹聚合物及医用材料表面修饰,该印迹聚合物对模板蛋白质 的吸附量达到了 13.67mg/g,与非印迹聚合物相比提高了 27.7倍;对不同蛋白质 的吸附测试结果表明,该印迹聚合物对于模板蛋白质具有较好的特异选择性吸附 效果。
1.4本论文立题的目的和意义
研究蛋白质和酶对了解生命规律、引导工业生产、医药实践有着重大的理论 与实践意义,而蛋白质和酶的分离纯化是蛋白质与酶研究中必不可少的一个环 节。蛋白质分子印迹技术能特异性吸附分离模板蛋白,但传统的蛋白质印迹技术 依然存在一些问题,例如聚合时容易导致蛋白质分子变性失活,蛋白质分子体积 比较庞大,传统的印迹方法对蛋白质较难洗脱等,因此目前蛋白质印迹技术发展 的关键是寻找相对温和的制备方法与洗脱环境。
生物医用高分子材料是材料科学技术中一个正在迅速发展的领域,不仅技术 含量和经济价值量高,而且与患者生命和健康密切相关。现代医学中使用的生物 材料为实现新的医疗手段提供了良好的物质基础,成为现代生物医学工程中的重 要部分。但是这些材料在实现其临床功能的同时,也带来了一系列不良生物反应, 例如术后的感染、炎症反应、血栓、组织增生、细胞毒性等,这些不良的反应都 来源于材料本身与生物体的不相容性。因此,材料与生物体之间的相容性一直是 从事生物材料研究的学者们所关注和研究的科知识题。
层层自组装技术工艺简单,厚度可控,制备条件温和,可实现多种生物分子 的表面固定,并有利于生物分子维持生物活性和天然构象,适用于具有复杂体型 结构的材料,已成为生物材料吸附与表面固定的研究热点。
本工作拟将生物大分子材料一羧甲基纤维素和溶菌酶所具有的生物相容性 以及抗菌活性等生物活性,并结合层层自组装技术,制备溶菌酶分子印迹聚合物 以及进行聚氨酯医用材料表面修饰研究,为蛋白质选择性吸附分离研究和医用材 料表面修饰研究提供了新的思路和方法。
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1.5本论文的研究内容及设计思路
本论文的主要研究内容如下:
(1)以羧甲基纤维素为天然功能单体,溶菌酶为模板分子,结合层层自组装 技术来制备溶菌酶分子印迹聚合物,该印迹聚合物制备条件温和,制备方法较简 单。然后利用水接触角测试、扫描电子显微镜等方法对层层自组装过程以及印迹 聚合物表面的形貌进行分析和表征,并对印迹聚合物对于模板蛋白质的选择性吸 附效果和可重复使用性能进行了分析。
(2)采用层层自组装技术,将具有良好生物相容性以及具有抗菌活性等生物 活性的生物大分子材料一溶菌酶与羧甲基纤维素接枝到聚氨酯材料表面,希翼能 提高材料的抗菌活性、血液相容性等生物性能。采用水接触角、原子力显微镜、 抗菌测试和溶血试验等对层层自组装的过程、材料的表面形貌以及材料的表面生 物性能等进行了测试和分析。
14 
 
V
羧甲基纤维素与溶菌酶在基 材表面的层层自组装
 
制备羧甲基纤维素的溶 菌酶印迹聚合物羧甲基纤维素与溶菌酶对 聚氨酯基材的表面修饰
f/
水接触角、IR、水接触角、AFM、表
SEM、蛋白质吸附面羧基密度测定、
测试等抗菌活性、血液相
容性测试等
图1-4本论文设计思路
15
本论文设计思路如图1-4:
羧甲基纤维素基材的聚氨酯基材的制备及
制备表面官能化
第二章以羧甲基纤维素为基材的层层自组装溶菌酶
印迹聚合物的制备
2.1引言
蛋白质是生命的基础物质,它存在于人体的每一种组织与每一种细胞中,它 参与了人体的生长发育、繁殖、遗传、新陈代谢与运动等全部的生命活动过程。 因此蛋白质的吸附分离已成为一个非常重要而活跃的研究领域。随着科技进步, 使得新型分离技术的开发,需求迫切。分子印迹技术能产生对模板蛋白的特异吸 附位点,该吸附位点具有对模板蛋白的形状、大小与电荷分布的印迹能力,能特 异性吸附分离模板蛋白。近年来,分子印迹技术在对蛋白质的印迹上取得了可喜 进展,已经成功印迹了多种蛋白质,如牛血清蛋白、血红蛋白、蛋白酶、溶菌酶 等。但是将分子印迹技术用于蛋白质分离方面仍然存在一些问题,例如,聚合时 易导致蛋白质失活,模板蛋白质分子体积太大难以洗脱等,另外由于蛋白质几乎 不溶于有机溶剂,其分子印迹过程应该主要是在水溶液中进行的。因此,对功能 单体和印迹方式的选择就显得极为重要,这就要求大家寻找一种条件温和的蛋白 质印迹方法来解决上述问题。
层层自组装(Layer-by-layer assembly, LbL)技术是近年来发展起来的新自组 装技术,该技术的主要特点是在荷电的基材表面通过静电相互作用交替地吸附上 带相反电荷的聚电解质离子。该技术具有许多优点,如组装分子的选择范围广泛, 其制备工艺简单,制备条件温和,可在常温水溶液中进行,可以有效保持生物分 子具有维持生物活性的天然构象,利用自组装方法构筑多糖和蛋白质多层膜的研 究已有文献报道[69?72]。Shi[66]等人结合层层自组装与光交联的方法制备的分子印 迹聚合物对模板分子具有良好的选择性吸附能力。
羧甲基纤维素是一种重要的水溶性纤维素醚类衍生物,由于具有无毒、可降
解和可再生等优点而被广泛地用于各种生物膜材料[73'76]。与聚N-异丙基丙烯酰
胺凝胶相比,由于羧甲基纤维素的引入,使凝胶聚N-异丙基丙烯酰胺与羧甲基
纤维素的交联互穿网络聚合物在最佳吸附条件下对蛋白质的吸附能力提高[77]。
Chen[78]等人研究了壳聚糖/竣甲基纤维素共混膜对溶菌酶的吸附行为,在pH为
9.2时共混膜对溶菌酶吸附能力最大,此时共混膜与蛋白质之间的相互作用主要
是带负电的羧甲基纤维素与带正电的溶菌酶之间的相互作用。Fujim〇to[79]等人研
16
究了表面接枝了羧甲基纤维素的膜与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用,随着 羧甲基纤维素的取代程度增加,羧甲基纤维素与BSA相互作用增加,同时pH 也是影响膜对BSA吸附能力的一个重要因素。
由于纤维素衍生物良好的成膜性,以纤维素衍生物为支撑体来制备分子印迹 聚合物己有文献报道。张茂升18()]等以0.45^111混合纤维素酯膜为支载膜,丙烯酰 胺为功能单体,N,N'-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂,通过表面印迹法制备牛血清 白蛋白分子印迹膜,结果表明,相较于非印迹膜而言,该分子印迹膜表现出良好 的识别渗透能力。李婧娴[81]等采用湿相转化法制备了以活性艳蓝为印迹分子的 醋酸纤维素-聚偏二氟乙烯分子印迹膜,所制得的分子印迹膜是一种特异分子吸 附膜,对印迹分子具有亲和性。
基于上述研究背景,本工作以羧甲基纤维素为天然功能单体,溶菌酶为模板 分子,结合层层自组装技术来制备溶菌酶分子印迹聚合物。该印迹聚合物制备条 件温和,制备方法较简单,有利于减少制备过程对蛋白质变性失活的影响,为目 前蛋白质的吸附和分离提供一种新的方法。
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2.2实验部分
2.2.1实验材料及仪器设备
本实验主要药品如表2-1所示:
表2-1主要试剂和药品
药品名称规格厂家
澳门威利斯人88038(CMC)化学纯国药集团化学试剂有限企业
三氯化铁(FeCl3 • 6H20)分析纯国药集团化学试剂有限企业
磷酸氢二钠(Na2HP04 • 12H20) 分析纯国药集团化学试剂有限企业
磷酸二氢钠(NaH2P04 *21120) 分析纯国药集团化学试剂有限企业
乙醇分析纯国药集团化学试剂有限企业
甘油分析纯国药集团化学试剂有限企业
溶菌酶(Lys)生化试剂国药集团化学试剂有限企业
(BR)
牛血清白蛋白(BSA)Sigma分装
氯化钠(NaCl)分析纯天津市永大化学试剂有限企业
本实验主要仪器如表2-2所示:
表2-2主要实验仪器
仪器规格厂家
恒温磁力搅拌器85-2 型巩义市予华仪器有限责任企业
电热鼓风干燥箱101-OA泰斯特仪器有限企业
真空干燥箱DZ-1A泰斯特仪器有限企业'
恒温摇床HQ45Z 武汉中科科仪发展有限责任企业
紫外-可见光分光光度计UV-7504上海欣茂仪器有限企业
pH计PHS-3C上海雷磁仪器厂
TopPette移液器P200、P_DragonMed
超声清洗KQ-50E昆山市超声仪器有限企业
接触角仪C201上海梭伦科技
傅里叶变换红外光谱仪NexusThermo Nicolette, U.S
扫描电子显微镜 JSM-5610LVJEOL Ltd., Japan
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2.2.2层层自组装溶菌酶印迹聚合物的制备
(1)制备羧甲基纤维素膜片
配制浓度为30 g/L的羧甲基纤维素(CMC)水溶液,并加入20 %无水乙醇 和1.5 %的甘油,磁力搅拌至半透明、无颗粒的胶状体,然后将此胶体涂布于光 滑洁净的玻璃表面皿里,置于温度为65°C的干燥箱中干燥成膜,倒入8.5%的 FeCl3溶液浸泡20分钟后倒出并用蒸馏水清洗膜片表面,自然风干,剥下,得 到黄色透明的羧甲基纤维素膜,记为C-CMC。将所得C-CMC膜片用打孔器制 成直径为7.0mm,厚度约为0.3mm的圆形膜片,然后用乙醇超声清洗3次(每 次5min)。清洗完毕后室温干燥备用。为与印迹聚合物比较起见,C-CMC记为 NIP (非印迹聚合物,Non-imprintedpolymer)。
(2)羧甲基纤维素与溶菌酶在羧甲基纤维素基材表面的层层自组装
将羧甲基纤维素溶解于憐酸盐缓冲溶液(0.2M,pH7.4)中,其中羧甲基纤 维素浓度为3mg/mL;将溶菌酶(Lys)溶解于磷酸盐缓冲溶液(0.2M,pH7.4) 中,其中溶菌酶浓度为lmg/mL。将羧甲基纤维素膜片置于PH7.4磷酸盐缓冲 溶液中浸泡0.5 h,用去离子水清洗4-6次,然后将膜片置于溶菌酶的磷酸盐缓冲 溶液中反应20 min,分离出膜片后用磷酸盐缓冲溶液反复清洗4-6次,再将膜片 加入到羧甲基纤维素的磷酸盐缓冲溶液中反应20 min,分离出膜片后用磷酸盐缓 冲溶液反复清洗4-6次,完成基材表面的第一个双分子层自组装。重复上述过程, 在两种溶液中分别交替自组装5次后,得到羧甲基纤维素为最外层的表面含5 个双分子层的膜片。其中C-CMC代表未经层层自组装修饰的羧甲基纤维素膜片, C-CMC/Lys代表自组装一个溶菌酶分子层的膜片,C-CMC/(Lys-CMC)代表自组 装第一个双分子层,最外层为羧甲基纤维素的膜片,C-CMC/Lys-(CMC-Lys)代表 自组装第一个双分子层,最外层为溶菌酶的膜片,依次类推。
(3)溶菌酶在自组装羧甲基纤维素基材表面的印迹
将上述步骤(2)制备的膜片用去离子水反复清洗,然后浸入8.5 %的FeCl3 溶液在25°C条件下反应20 min,然后用去离子水反复清洗4-6次,平铺于平底 玻璃盘中自然风干。
(4)模板蛋白质的洗脱
将上述步骤(3)所得到的竣甲基纤维素膜片采用5M氯化钠溶液作为洗脱 液洗脱模板蛋白质,溶菌酶与羧甲基纤维素层层自组装的省略印迹聚合物及医用材料表面修饰,采用紫外-可见分光光度计在280 nm波长处检测洗脱液中溶 菌酶含量,直至洗脱液中溶菌酶吸光值为0,即制备了羧甲基纤维素的层层自组 装溶菌酶印迹聚合物,记为MIP(印迹聚合物,Molecularly imprinted polymer)。
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2.2.3水接触角表征
采用接触角测试仪(C201,上海梭伦科技)表征溶菌酶与羧甲基纤维素在 羧甲基纤维素膜片表面层层自组装过程中表面水接触角的变化。将2pL的去离 子水滴在待测膜片表面,待稳定后测出膜片与水滴的左右两个夹角,每个样品测 量6次,其平均值为最终的水接触角,其标准偏差为接触角的误差。
2.2.4羧甲基纤维素膜溶胀率测定
取一定质量(m〇)的C-CMC膜片置于pH为7.4,离子强度为0.2的磷酸盐 缓冲溶液中,隔一段时间将膜片取出用滤纸吸干膜片表面水分,称量并记录其质 量(n^),计算其溶胀率,计算方法如公式(2-1)。
溶胀率Wnn-moVmoXlOO%公式(2-1)
2.2.5红外光谱测试
澳门威利斯人88038、氯化铁改性的澳门威利斯人88038分别用红外光谱仪(Thermo Nicolette,U.S)进行表征,采用KBr压片法制样后在^(MOOOcm—1波长范围内扫
描。
2.2.6扫描电镜(SEM)测试
印迹与非印迹的羧甲基纤维素膜片用场发射扫描电子显微镜(JSM- 5610LV, JEOLLtd., Japan)观察其表面形貌的变化,对于不导电的羧甲基纤维素样品,观 察前需在表面喷镀一层导电金属,镀膜厚度控制在5-10nm。
2.2.7蛋白质吸附测试
(1)模板蛋白质吸附测试
首先采用紫外-可见分光光度计(UV-7504,上海欣茂仪器有限企业)测试模 板蛋白质在磷酸盐缓冲溶液里的标准曲线,然后测试印迹聚合物(MIP)与非印 迹聚合物(NIP)对模板蛋白质的吸附量。
标准曲线的测定方法为:配制几个已知浓度的蛋白质溶液,测定每种浓度溶 液在280nm处的吸光值,以浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制趋势线即为 标准曲线。
20
取MIP及NIP膜片相同质量各0.5 g (ma),分别加入相同体积的模板蛋白 质溶菌酶(lmg/mL)溶液8 mL,密封后置于摇床上室温震荡吸附,每隔一段时 间测定蛋白溶液的吸光值直至读数稳定不变达到吸附平衡为止。采用如下公式计 算蛋白质的吸附量:
Q=(C〇-Ce)XV/ma公式(2-2)
C〇一蛋白吸附的初始浓度(mg/mL);
Ce—蛋白质吸附过程中的平衡浓度(mg/mL);
V—蛋白溶液的体积(mL);
ma—膜片的重量(g)。
印迹聚合物对模板蛋白质的印迹效果采用印迹因子(〇0来评价[82]。
a = QMIP/QNIP公式(2-3)
其中QMIP和QNIP分别为MIP及NIP及对于蛋白质的吸附量。
(2)蛋白质选择性吸附测试
首先测试牛血清白蛋白BSA、溶菌酶Lys在磷酸盐缓冲溶液里的标准曲线, 然后采用紫外-可见光分光光度计(UV-7504,上海欣茂仪器有限企业)测试经层 层自组装印迹前后对非模板蛋白质吸附量的变化。分别取〇.5gMIP及NIP膜片 置于分别含有8 mL的BSA (1 mg/mL)、Lys (1 mg/mL)的2种蛋白质磷酸缓 冲溶液的烧杯中震荡吸附,达到平衡后,采用紫外-可见分光光度计在280nm波 长处检测各烧杯中的蛋白质浓度,测试MIP、NIP两种聚合物膜片对于这两种蛋 白质的吸附量。
(3)模板蛋白质再吸附测试
将吸附有模板蛋白的羧甲基纤维素的层层自组装溶菌酶印迹聚合物采用5M 氯化钠作为洗脱剂洗脱除去模板后,再将洗脱后的溶菌酶印迹聚合物浸入溶菌酶 溶液中进行震荡吸附直至达到吸附平衡,重复上述洗脱与吸附步骤,并采用紫外 -可见分光光度计在280 nm波长处检测溶液中的模板蛋白质浓度,测试印迹聚合 物对于模板蛋白质再次吸附量的变化。
21
2.3结果与讨论
 
2.3.1羧甲基纤维素膜的制备
图2-1氯化铁改性前后羧甲基纤维素膜的红外光谱图
 
0.5
11.5
时间00
图2-1为氯化铁改性前后羧甲基纤维素膜的红外光谱图,如图所示,CMC 代表未改性羧甲基纤维素,C-CMC代表改性后羧甲基纤维素,与CMC的谱图 相比,OCMC在1614cm—1和1423 cnT1左右的-COO_振动特征吸取峰发生了移动, 这说明CMC上的-COO_与氯化铁发生了化学反应[83]。
2.5
图2-2C-CMC膜片在磷酸盐缓冲溶液(0.2M,pH7.4)中的吸水率
图2-2为C-CMC膜片在磷酸盐缓冲溶液中吸水率随时间的变化情况。如图 所示,经过0.5小时后,膜片已经达到溶胀平衡,吸水率为80%左右;然后超
22
过0.5小时以后,C-CMC膜片吸水率变化不明显。此外,未经氯化铁溶液处理 的CMC膜片,在憐酸盐缓冲溶液中发生溶解。上述吸水率测试结果初步说明, 经过氯化铁溶液处理后,C-CMC膜片产生了一定程度的交联。
SK8 7 6 5 4 3 2 1
r- —2
 
/
 
2.3.2水接触角表征
图2-3层层自组装过程中羧甲基纤维素膜片表面的水接触角
图2-3为层层自组装过程中羧甲基纤维素膜片表面的水接触角变化情况,其 中C-CMC代表未经层层自组装修饰的羧甲基纤维素膜片,C-CMC/Lys代表自组 装一层溶菌酶分子层的膜片,溶菌酶与羧甲基纤维素层层自组装的省略印迹聚合物及医用材料表面修饰,C-CMC/(Lys-CMC)代表自组装第一层双分子层, 最外层为羧甲基纤维素的膜片,C-CMC/Lys-(CMC-Lys)代表自组装第一层双分子 层,最外层为溶菌酶的膜片,依次类推。如图所示,层层自组装修饰过程中聚氨 醋表面的水接触角呈锯齿状下降趋势,C-CMC膜片的水接触角为71.0°,组装一 层溶菌酶分子使膜片的水接触角下降为44.0°,当层层自组装达到五层双分子层 时膜片表面的水接触角逐渐达到稳定值(接触角为28.7 °)。以上结果表明经过 层层自组装修饰后C-CMC膜片表面水接触角降低,亲水性得到改善。
2.3.3印迹聚合物(MIP)与非印迹聚合物(NIP)表面形貌分析
采用扫描电镜观察非印迹聚合物膜片与印迹聚合物膜片的表面形貌。
23
 
图2-4 MIP与NIP表面的扫描电镜图
图2-4为印迹前后羧甲基纤维素膜片表面的扫描电镜图,其中图2-4a为MIP 的表面形貌图,图2-4b为NIP的表面形貌图。如图所示,MIP表面相对于NIP 表面更粗糙,并且表面出现了尺寸大约O.l^m左右的微孔结构。这些微孔结构的 出现增加了羧甲基纤维素的比表面积,有利于增加模板蛋白质的吸附量。另外, 由于MIP表面出现了较多的微孔结构,这些微孔结构有利于模板蛋白质在印迹 聚合物表面进行吸附和扩散,这将有利于避免相对处于内层的蛋白质在后续的分 离过程中难以洗脱的问题,并为蛋白质的洗脱和再吸附提供了条件。
2.3.4蛋白质吸附测试
c2axz)uon&ospv >n
 
聚合物对蛋白质的吸附能力是根据溶液中蛋白质的浓度变化来计算,而溶液 中的蛋白质浓度是根据蛋白质吸光度的标准曲线来计算的。配制一定浓度的蛋白 质标准溶液,在280 nm处采用紫外-可见分光光度计测定每种浓度溶液的吸光 度,以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。图2-5为溶菌酶(Lys) 与牛血清白蛋白(BSA)在磷酸盐缓冲溶液(0.2M, pH7.4)中的标准曲线。
图2-5溶菌酶(Lys)与牛血清白蛋白(BSA)吸光度标准曲线
24
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A UPNIP
图2-6 MIP与NIP对模板蛋白的吸附量
图2-6表示了 MIP及NIP对模板蛋白溶菌酶的吸附量。从图中可以看出, MIP对溶菌酶的吸附量为144.02mg/mL,NIP对溶菌酶的吸附量为98.83 mg/mL, 相比NIP, MIP对模板蛋白的吸附能力提高了 50%左右。通过公式(2-3)计算 得到MIP的印迹因子a为1.5左右。以上结果说明制备的羧甲基纤维素的层层自 组装溶菌酶印迹聚合物有效提高了对模板蛋白溶菌酶的吸附量和吸附能力。
表2-3 MIP与NIP对不同蛋白质的吸附量
样品吸附能力(mg/mL)
LysBSA
MIP144.020
NIP98.833.17
表2-3为Mff和NIP对模板蛋白(Lys)和参比蛋白(BSA)吸附能力的比 较。从表中可以看出MIP对模板蛋白的吸附量为144.02mg/mL, MIP对参比蛋 白没有吸附能力,NIP对模板蛋白和参比蛋白的吸附量分别为98.83 mg/mL和 3.17mg/mL,相比非印迹聚合物,制备的印迹聚合物对模板蛋白的吸附能力提高, 而对参比蛋白的吸附能力下降。以上结果表明,印迹聚合物对模板蛋白质Lys 的选择性识别能力提高。
25
(3>l!a10JdMUI) s!0*sp«dK3 uopcuosp<
 
First Second Third Fourth
图2-7 MIP对模板蛋白的再吸附量
图2-7为羧甲基纤维素的层层自组装溶菌酶印迹聚合物经过重复洗脱后对模 板蛋白质溶菌酶的吸附量。如图所示,MIP第二次再吸附时的吸附量与第一次相 比变化不明显,第三次再吸附时的吸附量为第一次吸附能力的70%左右,而第四 次再吸附量为第一次的50%左右。以上结果表明,该溶菌酶印迹聚合物具有良好 的可重复利用性能。
2.4本章小结
本工作以羧甲基纤维素为天然功能单体,利用层层自组装技术与分子印迹技 术相结合,制备溶菌酶分子印迹聚合物,主要结论如下:
1、以羧甲基纤维素为天然功能单体,以溶菌酶为模板蛋白质分子,通过层 层自组装技术将带相反电荷的羧甲基纤维素和溶菌酶交替吸附到羧甲基纤维素 基材表面进行蛋白质印迹,制备了羧甲基纤维素的层层自组装溶菌酶印迹聚合 物。
2、水接触角测试表明,经过羧甲基纤维素与溶菌酶层层自组装修饰后的竣 甲基纤维素膜片表面的水接触角明显下降。扫描电镜图片显示,印迹聚合物的表 面相对于非印迹聚合物表面变的粗糙,并且表面出现了微孔结构。
3、蛋白质吸附测试表明,与非印迹聚合物相比,羧甲基纤维素的层层自组 装溶菌酶印迹聚合物对于模板蛋白质溶菌酶的吸附量提高了 50%左右,并且该印 迹聚合物对于模板蛋白质具有选择性吸附效果,再吸附测试表明该溶菌酶印迹聚 合物具有良好的可重复利用性能。
26
第三章羧甲基纤维素与溶菌酶层层自组装修饰聚氨
酯材料的研究
3.1 引 g
聚氨酯全称为聚氨基甲酸酯,是主链上含有重复氨基甲酸酯基团的大分子化 合物的统称。它是由有机二异氰酸酯或多异氰酸酯与二羟基或多羟基化合物加聚 而成。通过改变原料种类及组成,可以大幅度地改变产品形态及其性能,得到从 柔软到坚硬的最终产品。
在聚氨酯弹性体中,由于软硬段的不相容性,存在明显的微相分离结构,其 中软段提供弹性,硬段起到增强填充和交联作用,分子结构中的软硬段的极性差 异使其具有良好的生物相容性。聚氨酯由于其突出的物理机械性能和良好的生物 相容性在制造植入人体的各种器件如人工肺、人工心脏瓣膜、人工皮肤、人工血 管等领域有巨大的应用前景[84]。然而,普通生物医用材料作为内置材料在植入 人体后会产生一系列不良生物反应,如术后的炎症反应、血栓和细胞毒性等[85]。 这些不良反应均来源于材料与生命环境的生物不相容性反应。医用高分子材料植 入人体后,最先和直接与组织、细胞相接触和作用的是材料的表面。因此,医用 高分子材料的表面性能是影响其生物相容性的主要因素之一,它将影响细胞吸 附、增殖、分化等一系列反应。传统的表面修饰手段包括物理共混和表面化学接 枝等,但是采用简单的物理共混方式制备的材料可控性差[86],而表面化学接枝 一般制备步骤繁杂且较难在具有复杂形状结构的人造器官和装置上实现[87]。溶菌酶与羧甲基纤维素层层自组装的省略印迹聚合物及医用材料表面修饰,因 此寻求一种易行、有效的表面修饰手段成为医用装置表面设计的关键性问题。
层层自组装(Layer-by-layer assembly, LbL)技术是一种在材料表面交替吸附 带相反电荷聚电解质的技术,该技术有很多优点,例如操作条件温和,能在常温 水溶液中进行•,使用范围广泛,蛋白质、酶、生物多糖等天然高分子均可以进行 层层自组装而且不会变性失活;可控性强,能在分子尺度和纳米级别对材料表面 进行改性;另外,该方法适用的基体材料范围广泛,能在形状复杂的器件上实施。 因此利用层层自组装技术对生物医用材料进行表面改性是一种理想的方法。 Tan[8S]等人在材料表面进行了聚乙烯亚胺与肝素的层层自组装,经自组装后的材 料能够抵抗血小板的粘附,并能延长静态凝固时间,抗凝血功能提高,该方法为
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心脏血管装置的表面改性提供了一种新方法。丁丨化^^^等人利用层层自组装技 术对金属支架表面进行改性,他们将透明质酸/壳聚糖LbL多层膜组装到金属支架 表面,提高了材料的抗凝血性能。Cai™等人将壳聚糖/明胶LbL多层膜组装到钛 材料表面,骨细胞生长实验表明经LbL改性后的钛材料表面细胞相容性提高。Zhu [91]等利用静电自组装的方法将带异种电荷的聚乙烯亚胺和明胶交替沉积在聚 (D-赖氨酸-丙交酯)(PDL-LA)基质表面制备了一种类细胞外基质,并以软骨 细胞为模板研究了这种改性PDL-LA基质表面的细胞行为(细胞的黏附、增殖和 活性)和形态,结果显示经多层膜表面修饰后PDL-LA基质能够促进软骨细胞的 黏附和生长。
溶菌酶(Lysozyme)又称胞壁质酶(Muramidase)或N-乙醜胞壁质聚糖水 解酶(N-acetylmuramideglycanohydrlase),是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性
酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的0 -1,4糖 苷键,使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,导致细胞壁破裂内容物逸出而 使细菌溶解。该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。将溶菌酶接枝到生物医用材 料表面可以提高材料的抗菌活性和生物相容性。MUSZamka[92]等人将溶菌酶接枝 到聚氧化乙烯分子链表面,接枝后的材料具有优良的抗菌性。王强[93]等人通过 层层自组装技术将溶菌酶/聚苯乙烯磺酸钠LbL多层膜组装到羊毛纤维表面,由 于溶菌酶具有抗菌能力,与未改性羊毛相比改性后的羊毛表面抗菌率最高可达 91.7%。Conte[94]等人通过等离子表面改性技术将溶菌酶固定到聚乙烯薄膜上,结 果表明接枝了溶菌酶后的膜具有抗菌性。
本工作采用层层自组装技术,将具有良好生物相容性以及具有抗菌活性等生 物活性的生物大分子材料一溶菌酶与羧甲基纤维素接枝到聚氨酯材料表面,希翼 能提高材料的抗菌活性、血液相容性等生物性能。采用水接触角、原子力显微镜、 抗菌测试和溶血试验等对层层自组装的过程、材料的表面形貌以及材料的表面生 物性能等进行了测试和分析。
28 
3.2实验部分
3.2.1实验材料及仪器设备 本实验所用药品如表3-1:表3-1主要实验药品
药品名称规格厂家
澳门威利斯人88038(CMC)化学纯国药集团化学试剂有限企业
磷酸氢二钠分析纯国药集团化学试剂有限企业
(Na2HP04 * 12H20)
磷酸二氢钠分析纯国药集团化学试剂有限企业
(NaH2P04 * 2H20)
溶菌酶(Lys)生化试剂(BR)国药集团化学试剂有限企业
甲苯分析纯国药集团化学试剂有限企业
乙腈分析纯国药集团化学试剂有限企业
三乙胺(TEA)分析纯天津博迪化工有限企业
N,N-二甲基甲酰胺(DMF)分析纯国药集团化学试剂有限企业
4,4’ -二苯基甲烷二异氰酸酯纯度98%Aldrich
(MDI)
乙二胺分析纯国药集团化学试剂有限企业
牛肉膏生化试剂(BR)国药集团化学试剂有限企业
蛋白胨生化试剂(BR)国药集团化学试剂有限企业
琼脂粉生化试剂(BR)国药集团化学试剂有限企业
氯化钠分析纯国药集团化学试剂有限企业
Rhodamine 6G纯度95%Sigma分装
丙烯酸分析纯天津市福晨化学试剂有限企业
盐酸分析纯国药集团化学试剂有限企业
牛血清白蛋白(BSA)Sigma分装
大肠杆菌中国典型培养物保藏中心
金黄色葡萄球菌中国典型培养物保藏中心
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本实验主要仪器如表3-2所示:
表3-2主要实验仪器
仪器规格厂家
恒温磁力搅拌器85-2 型巩义市予华仪器有限责任企业
电子天平DT302常熟意欧仪器仪表有限企业
电热鼓风干燥箱101-OA泰斯特仪器有限企业
真空干燥箱DZ-1A泰斯特仪器有限企业
恒温摇床HQ45Z武汉中科科仪发展有限责任企业
紫外-可见光分光光度计UV-7504上海欣茂仪器有限企业
pH ifPHS-3C上海雷磁仪器厂
TopPette移液器P200、PioooDragonMed
超声清冼KQ-50E昆山市超声仪器有限企业
接触角仪C201上海梭伦科技
扫描探针显微镜DI Nanoscope IVVeeco Metrology Group (U.S)
立式压力蒸汽灭菌器YXQ-Ls-75上海博迅实业有限企业医疗器设
11备厂
单人净化工作台SW-CJ-2D苏州净化设备有限企业
恒温培养箱DPX-9272B-1上海福玛实验设备有限企业
自动三重水蒸馏器SZ-97上海亚荣生化仪器厂
3.2.2聚氨酯薄膜的制备
将商用聚氨酯(PU)颗粒18?21g装入索氏提取器中先后用甲苯、甲醇各 索氏提取48h。再将纯化后的聚氨酯乳胶粒溶于提纯后的N,N’-二甲基甲酰胺 (DMF)中,待搅拌完全溶解后将溶液倒入平底成膜盘内(D=12cm),在65°C 条件下干燥48h,待溶剂完全挥发后经真空干燥得聚氨酯薄膜状基材,将所得聚 氨酯薄膜状基材用打孔器制成直径为7.0mm,厚度约为0.3mm的圆形膜片,然 后分别用甲苯、乙醇各超声清洗3次(每次5min)。清洗完毕后真空干燥备用。
30
3.2.3用4, 4’-二苯基甲烷二异氰酸酯对聚氨酯基材表面进行官能化
将3.2.3中的聚氨酯膜片加入到60mL质量百分比为7.5%的4, 4,-二苯基甲 烷二异氰酸酯(MDI)的甲苯(经蒸馏提纯)溶液中,搅拌并升温至50°C,通 入氮气保护,然后将三乙胺按照质量百分比为MTEA/MTcluene=2.5%的比例加入反 应体系,混合均匀后反应lOOmin。反应结束后用甲苯和乙腈反复清洗膜片4?6 次,除去表面物理吸附的MDI,即为表面异氰酸酯化的聚氨酯膜片。其中TEA 是三乙胺,Toluene是甲苯。
3.2.4聚氨酯基材表面接枝氨基及基材表面带正电
将3.2.3中表面异氰酸化的聚氨酯膜片加入到60mL质量百分比为2%的乙二 胺的甲苯(经蒸馏提纯)溶液中,室温下搅拌反应100 min,得到表面带有氨基 官能团的聚氨酯膜片,再用蒸馏水反复清洗膜片4?6次,并用去离子水清洗过 夜。干燥后将膜片在室温下用0.012M盐酸浸泡30 min,再用去离子水反复清洗 膜片4?6次,经真空干燥后得表面带正电荷的氨基化聚氨酯膜片。
3.2.5羧甲基纤维素和溶菌酶在氨基化聚氨酯表面的层层自组装
将羧甲基纤维素溶于200mL磷酸盐缓冲溶液(0.2M, pH7.4)中,其中羧甲 基纤维素的浓度为3mg/mL;将溶菌酶溶解于200mL磷酸盐缓冲溶液(0.2M, pH7.4)中,其中溶菌酶的浓度为lmg/mL。将表面氨基官能化后的带正电荷的 聚氨酯膜片加入到羧甲基纤维素溶液中反应15?20min,分离出膜片后用相应的 缓冲溶液反复清洗4?6次,制备出表面具有羧甲基纤维素的PU/CMC膜片。再 将PU/CMC膜片加入溶菌酶溶液中反应15?20min,分离出膜片后用相应的缓冲 溶液反复清冼4?6次,完成基材表面的第一层双分子层自组装;重复上述过程, 在两种溶液中分别交替自组装5次后,得到溶菌酶为最外层的含五层双分子层的 表面自组装多层膜,最后将膜片在30°C条件下真空干燥48h,即制备得到层层自 组装修饰的具有生物相容性的聚氨酯材料。其中PU代表未经层层自组装修饰的 聚氨酯膜片,PU-NH2代表表面氨基官能化的膜片,PU/(CMC-Lys)代表组装了一 层双分子层且溶菌酶为最外层的膜片,PU/CMC-(Lys-CMC)代表组装了一层双分 子层且羧甲基纤维素为最外层的膜片,依次类推,PU/(CMC-Lys)5代表组装了五 层双分子层且溶菌酶为最外层的膜片。
3.2.6水接触角测试
本实验采用接触角测试仪(C201,上海梭伦科技)表征聚氨酯膜片层层自
31
组装修饰过程中亲水性的变化。将2pL的去离子水滴在待测聚氨酯膜片表面, 待稳定后测出膜片与水滴的左右两个夹角,每个样品测量6次,其平均值为最终 的水接触角,其标准偏差为接触角的误差。
3.2.7原子力显微镜(AFM)
用扫描探针显微镜(DINan〇SC〇peIV,U.S)采用轻敲模式观察聚氨酯膜片与 经层层自组装修饰的聚氨酯膜片表面形貌的变化。
3.2.8表面羧基密度测定
在聚氨酯表面进行羧甲基纤维素与溶菌酶进行层层自组装过程中,取出最外 层为羧甲基纤维素的膜片测定其表面羧基密度。将膜片用去离子水清洗干净后, 65°C的条件下真空干燥24 h。采用83^95]等先容的方法来测定膜片表面羧基密 度。将4mg Rhodamine6G溶于4mL憐酸盐缓冲溶液(pH12)中,然后加入分 液漏斗并加入lOOmL甲苯萃取,取上层液体即为制备出的 Rhodamine-Benzene(RB)染色剂溶液。将DMF与染色剂以4:1的比例混合,然后 加入定量的丙烯酸生成羧酸/罗丹明复合物。在535nm处用紫外-可见分光光度计 (UV-7504,上海欣茂仪器有限企业)测量这种羧酸/罗丹明复合物的吸光系数并 做出标准曲线。将膜片溶解到DMF-RB染色剂溶液中,并测量其在535nm处的 吸光系数。为了扣除空白聚氨酯的影响,空白聚氨酯也溶解到DMF-RB染色剂 溶液中,并测量其在535nm处的吸光系数。膜片表面的羧基密度可利用上述标 准曲线计算得到。
3.2.9抗菌活性测试
抗菌活性测试过程按照中华人民共和国轻工行业标准:《抗菌塑料一抗菌性 能测试方法和抗菌效果》[96]实行。实验时采用连续转接2次的新鲜细菌培养物 (24h内转接的),加入培养液中,依次做10倍递增稀释,选择合适浓度的稀释 液作为试验用菌液(选择菌液浓度的标准为固体培养皿上生长的菌落数量在 30-300这个范围内)。按照GB 4789.2《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》 [97]的方法操作。在每个培养管中加入2mL菌液,分别加入5片层层自组装修饰 前后的聚氨酯膜片,而不加入膜片的培养管作为空白对照组,在37°C恒温振荡 培养24小时后,用平板计数法计算出菌落数目。每组数据做两次平行实验,每 个样品做三个平行抗菌测试。
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抗细菌率计算公式为:
R(%) = (B-C) /BX100%公式(3-1)
R—抗细菌率(%)
B—空白对照样品平均回收菌数(CFU/片)
C一抗菌塑料样品平均回收菌数(CFU/片)
3.2.10溶血实验
层层自组装修饰前后聚氨酯膜片的血液相容性用溶血试验来表征。测试过程 参考中华人民共和国国家标准:GB/T 16175-2008《医用有机硅材料生物学评价 试验方法》[98]进行。将待测膜片放入含有10mL生理盐水的试管中,以10mL蒸 馏水的试管为阳性对照,10mL生理盐水的试管为阴性对照,将试管分别放入37 °C水浴中30min。将新鲜抗凝血液用生理盐水按4:5稀释,然后向每个试管中加 入0.2mL稀释的血液,在37°C恒温水浴中维持60 min。然后以2500r/min离心10 min。小心抽取上清液,紫外可见分光光度计UV-7504在545nm处测定其吸光度。 每组数据做两次平行实验,每个样品做三个平行测试。
溶血率计算公式为:
溶血率=[(AM-A_)/(A_-A 瞧)]x 100%公式(3-2)
其中A样品代表测试样品的吸光度,A酣代表阴性对照的吸光度,A阳性代表 阳性对照的吸光度。
3.3结果与讨论
3.3.1层层自组装修饰前后聚氨酯膜片水接触角表征
图3-1为聚氨酯膜片层层自组装过程中的水接触角变化,其中PU代表未经 表面修饰的聚氨酯膜片,PU-NH2代表表面氨基官能化的膜片,PU/(CMC-Lys) 代表组装了一层双分子层且溶菌酶为最外层的膜片,PU/CMC-(Lys-CMC)代表组 装了一层双分子层且羧甲基纤维素为最外层的膜片,依次类推,PU/(CMC-Lys)5 代表组装了五层双分子层且溶菌酶为最外层的膜片。如图所示,未进行表面修饰 的聚氨酯材料的水接触角为73.0°,氨基化改性后聚氨酯材料水接触角下降为 69.0°,经过层层自组装修饰后的聚氨酯的水接触角在组装完第一层双分子层后, 呈缓慢下降的趋势,当层层自组装达到五层双分子层时其水接触角为42.3°。以
33
上会〇果表明,经过层层自组装表面修饰后的聚氣酷材料表面的苯水性提同。溶菌酶与羧甲基纤维素层层自组装的省略印迹聚合物及医用材料表面修饰,而材 料表面亲水性的改善有利于提高材料生物相容性,陈宝林等将磺酸根通过聚氧乙 稀链为“间隔臂”复合在聚氨酯上时,不仅可通过有效地阻抗血小板的粘附,而 且可以有效阻抗内源和外源凝血途径;聚氧乙烯链的高亲水性和柔顺性、磺酸根 的负电性和降低材料表面电位的作用以及似肝素活性等多种抗凝血有利因素的 复合为改善材料的血液相容性提供了有效途径[1(W]。 
5 0 5 0 5 0 5 0 5 77665 5 443
 
 
 
图3-1层层自组装过程中聚氨酯膜片表面的水接触角
3.3.2表面羧基密度测定
在聚氨酯膜片表面进行羧甲基纤维素与溶菌酶层层自组装过程中,取出最外 层为羧甲基纤维素的膜片测定其表面羧基密度[95]。
表3-3层层自组装过程中聚氨酯膜片表面羧基密度
样品表面竣基密度((xmoL/cm2)
PU0
PU/CMC0.915
PU/CMC-(Lys-CMC)1.353
PU/CMC-(Lys-CMC)21.490
PU/CMC-(Lys-CMC)31.983
PU/CMC-(Lys-CMC)42.449
表3-3显示了层层自组装过程中聚氨酯膜片表面羧基密度的变化,其中PU
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代表未经层层自组装修饰的聚氨酯膜片,PU/CMC代表组装了一个溶菌酶单分子 层的膜片,PU/CMC-(Lys-CMC)代表组装了一个双分子层且羧甲基纤维素为最外 层的膜片,依次类推。如表所示,未改性的聚氨酯膜片表面无羧基存在;组装了 一层CMC单分子层后,膜片表面羧基密度增大为0.915pm〇L/Cm2,接着组装一 个双分子层后,膜片表面羧基密度为增加大1.353nm〇L/cm2,接着组装了四个双 分子层后,膜片表面羧基密度达到2.449pin〇L/Cm2。以上结果表明,随着聚氨酯 膜片表面组装的羧甲基纤维素层数的增加,膜片表面羧基密度是逐渐增大的。
3.3.3层层自组装修饰前后聚氨酯膜片的原子力显微镜表征
图3-2为层层自组装修饰前后聚氨酯膜片的原子力显微镜图片,其中PU代 表未经层层自组装修饰的聚氨酯材料,PU/(CMC-Lys)5代表溶菌酶为最外层组装 五个双分子层的聚氨酯材料。如图所示,与聚氨酯膜片相比,经层层自组装修饰 后的聚氨酯膜片其表面的凹凸结构有所增加。研究表明相比化学组成,材料的表 面形貌对材料的生物活性影响更大,材料表面纳米或微米级别的凹凸结构会加速 细胞在材料表面的粘附[1()1]。只£111111丨1^等人观察到微米或纳米尺度的表面形貌能 够促进细胞的粘附[1()2~1()4]。
 
PUPU/(CMC-Lys)5
图3-2层层自组装修饰前后聚氨酯AFM图
3.3.4层层自组装修饰前后聚氨酯膜片抗菌活性测试
研究表明,生物材料表面具有抑制细菌黏附和生长的生物活性,就能对植入 材料引起的术后感染及炎症反应起到有效控制和治疗作用。本工作对羧甲基纤维 素和溶菌酶表面层层自组装修饰的聚氨酯膜片进行了抗菌活性测试,选用大肠杆 菌和金黄色葡萄球菌作为测试用菌,由中国典型培养物保藏中心提供。
35
50
0
450
400
o o o o o o
5 0 5 0 5 0 3 3 2 2 1 1
rls/ply>01 x)
 
空白PUPU/(CMC-Lys)5
(as/njpolx)
 
空白PUPU/(CMC:-Lys)5
图3-4金黄色葡萄球菌与层层自组装修饰前后的聚氨酯共培养24h后的浓度
图3-3大肠杆菌与层层自组装修饰前后的聚氨酯共培养24h后的浓度
图3-3为层层自组装修饰前后聚氨酯膜片对大肠杆菌抗菌活性的比较,其中 空白代表未加入样品的空白培养基,PU代表未经层层自组装修饰的聚氨酯材料, PU/(CMC-Lys)5代表溶菌酶为最外层组装五个双分子层的聚氨酯材料。从图中可 以看出,经过24小时培养后,空白组的大肠杆菌的浓度为4.02X108 CFU/mL; PU组的大肠杆菌的浓度为3.80X 108 CFU/mL; PU/(CMC-Lys)5组的大肠杆菌浓 度为2.07X108CFU/mL。与未修饰聚氨酯相比,其抑菌率为45.5%。
图3-4为层层自组装修饰前后聚氨酯膜片对金黄色葡萄球菌抗菌活性的比 较,其中空白代表未加入样品的空白培养基,PU代表未经层层自组装修饰的聚 氨酯材料,PU/(CMC-Lys)5代表溶菌酶为最外层组装五个双分子层的聚氨酯材 料。如图所示,经过24小时培养后,空白组的金黄色葡萄球菌的浓度为3.7X 1〇8 CFU/mL; PU组的金黄色葡萄球菌的浓度为3.56Xl〇8CFU,mL; PU/(CMC-Lys)5 组的金黄色葡萄球菌浓度为2.09X108 CFU/mL,与未修饰聚氨酯相比,其抑菌
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率为41.4%。
以上结果表明,经过羧甲基纤维素和溶菌酶表面层层自组装修饰后的聚氨酯 材料表面具有抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性。溶菌酶是一种蛋白质 酶,通过溶解细菌的细胞壁而起到杀灭细菌的作用。溶菌酶对革兰式阳性菌 具有良好的溶菌作用,常见的如金黄色葡萄球菌[1<)6]、枯草杆菌[92]等,对大肠杆 菌[1()7]、普通变球菌[1G8]等革兰氏阴性菌也有溶解作用。利用层层自组装方法在聚 氨酯表面构筑多层的羧甲基纤维素和溶菌酶的表面修饰层有利于提高被修饰材 料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性。
3.3.5层层自组装修饰前后聚氨酯膜片溶血率测试
表3-4层层自组装修饰前后聚氨酯材料表面的溶血试验结果
样品吸光值溶血率(%)
阴性对照0.0413 ±0.00060
阳性对照0.8365±0.0106100
PU0.0523 ±0.00461.38
PU/(CMC-Lys)50.0443 土 0.00060.38
生物医用材料的溶血试验是测定红细胞溶解和血红蛋白游离的程度,溶菌酶与羧甲基纤维素层层自组装的省略印迹聚合物及医用材料表面修饰,是对生 物医用材料和制品的体外溶血性进行评价的体外实验,溶血试验能够反映出样品 与血液接触时对红细胞的破坏程度。表3-4为层层自组装修饰前后聚氨酯材料表 面的溶血试验结果,其中PU代表未经层层自组装修饰的聚氨酯材料, PU/(CMC-Lys)5代表溶菌酶为最外层组装五个双分子层的聚氨酯材料。如表中所 示,未经修饰的聚氨酯材料的溶血率为1.38%,而经过羧甲基纤维素与溶菌酶层 层自组装修饰的聚氨酯材料的溶血率为0.38%,这说明经层层自组装修饰后聚氨 酯材料对血液中的红细胞的破坏程度更小,与未改性聚氨酯材料相比溶血率降 低,材料的血液相容性得到一定程度的提高。相关研究也表明,利用竣甲基纤维 素对材料进行改性能提高材料的血液相容性[1(^11(>]。
3.4本章小结
通过表面层层自组装技术将生物多糖羧甲基纤维素与溶菌酶固定在氨基化 后的聚氨酯基材表面,其主要结果如下:
1、通过MDI与聚氨酯的反应将异氰酸酯基团引入聚氨酯基材表面,再与乙 二胺反应后得到表面带有氨基的聚氨酯基材。
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2、通过表面层层自组装技术将羧甲基纤维素和溶菌酶固定在表面氨基化的 聚氨酯基材表面。通过原子力显微镜对层层自组装修饰后的聚氨酯材料的表面形 貌进行了分析和表征,发现经层层自组装修饰后聚氨酯材料表面的凹凸结构有所 增加;水接触角测试表明经层层自组装修饰后膜片的亲水性得到改善;表面羧基 密度测试表明随着自组装层数增加,表面羧基密度逐渐增大。
3、通过抗菌性能的分析测试可知,层层自组装修饰后的聚氨酯材料具有较 好的抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的作用,与未经层层自组装修饰的聚氨酯基 材相比,对两种细菌的抑菌率分别为45.5%和41.4%。通过溶血率测试可知,经 过表面层层自组装改性后,溶血率由1.38%减少为0.38%,表明被修饰的聚氨酯 材料具有更好的血液相容性。
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第四章结论
本工作采用层层自组装方法,利用羧甲基纤维素与溶菌酶进行了溶菌酶印迹 聚合物和聚氨酯医用材料表面修饰的研究,主要结论如下:
1、以羧甲基纤维素为天然功能单体,以溶菌酶为模板蛋白质分子,通过层 层自组装技术将带相反电荷的羧甲基纤维素和溶菌酶交替吸附到狻甲基纤维素 基材表面进行蛋白质印迹,溶菌酶与羧甲基纤维素层层自组装的省略印迹聚合物及医用材料表面修饰,制备了羧甲基纤维素的层层自组装溶菌酶印迹聚合 物。水接触角测试表明,经过羧甲基纤维素与溶菌酶层层自组装修饰后的羧甲基 纤维素膜片表面的水接触角明显下降:扫描电镜图片显示,印迹聚合物的表面相 对于非印迹聚合物表面变的粗糙,并且表面出现了微孔结构。维素的层层自组装 溶菌酶印迹聚合物对于模板蛋白质溶菌酶的吸附量提高了 50%左右,并且该印迹 聚合物对于模板蛋白质具有选择性吸附效果,再吸附测试表明该溶菌酶印迹聚合 物具有良好的可重复利用性能。
2、通过MDI与聚氨酯的反应将异氰酸酯基团引入聚氨酯基材表面,再与乙 二胺反应后得到表面带有氨基的聚氨酯基材;通过表面层层自组装技术将羧甲基 纤维素和溶菌酶固定在表面氨基化的聚氨酯基材表面。通过原子力显微镜对层层 自组装修饰后的聚氨酯材料的表面形貌进行了分析和表征,发现经层层自组装修 饰后聚氨酯材料表面的凹凸结构有所增加;水接触角测试表明经层层自组装修饰 后膜片的亲水性得到改善;表面羧基密度测试表明随着自组装层数增加,表面羧 基密度逐渐增大。通过抗菌性能的分析测试可知,层层自组装修饰后的聚氨酯材 料具有较好的抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的作用,与未经层层自组装修饰的 聚氨酯基材相比,对两种细菌的抑菌率分别为45.5%和41.4%;通过溶血率测试 可知,经过表面层层自组装改性后,溶血率由1.38%减少为0.38%,表明被修饰 的聚氨酯材料具有更好的血液相容性。
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