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糖基化改性对罗非鱼肉肌原纤维蛋白功能特性的影响

发布日期:2014-12-30 21:49:29
糖基化改性对罗非鱼肉肌原纤维蛋白功能特性的影响
糖基化改性对罗非鱼肉肌原纤维蛋白功能特性的影响:
糖基化改性对罗非鱼肉肌原纤维蛋白功能特性的影响,选取葡萄糖、乳糖、壳聚糖、葡聚糖和羧曱基纤维素钠作为糖基供体对罗非鱼肉肌原纤维蛋白进行干热糖基化改性研究, 主要探讨糖的种类和改性程度对肌原纤维蛋白溶解性和热稳定性的影响。结果表明,糖与肌原纤维蛋白质量比为1:1时,在相对湿度 65%,温度50 °C条件下反应,小分子的葡萄糖和乳糖与蛋白干热反应的速度较快,随着反应时间(0~120h)的延长,改性程度增加, 产物的分子量逐渐增大,反应严格控制在前期阶段(6~12h)时,可以改善产物的溶解性,且在低离子强度溶液中改善更为明显;大 分子的壳聚糖、葡聚糖和羧曱基纤维素钠与蛋白反应的速度较慢,SDS-PAGE分析显示产物分子量变化不明显,而反应控制在20 h 左右时,产物的溶解性和热稳定性都能得到有效的改善;比较而言,糖基化改性对罗非鱼肉肌原纤维蛋白功能特性的影响,羧曱基纤维素钠对肌原纤维蛋白溶解性和热稳定性的改善效果最 好。综合分析,选择羧曱基纤维素钠作为糖基供体对罗非鱼肉肌原纤维蛋白进行进一步的糖基化改性研究。
大程度上制约了鱼肉蛋白的广泛利用。为了扩大鱼蛋 白在食品工业中的应用,提高水产品的附加值,有必 要对鱼蛋白进行改性以改善其功能特性。糖基化作用 (glycosylation)就是还原糖与蛋白质分子上游离赖氨 酸的a-NH2或e-NHa共价连接(即美拉德反应)而形 成糖蛋白的过程,结果可以明显改善蛋白质的热稳定 性、乳化性等,由此引起了国内外研究者极大的关注。 到目前为止,糖基化改性已应用于卵清蛋白[1,2]、片乳 球蛋白[3,4]、酪蛋白[5]、大豆蛋白[6]、鱼蛋白[7?11]和芸豆 蛋白[12]等,对改善蛋白质的溶解性[8,9,11]、热稳定性
[1?3,11]、乳化性[4,5,7,9,1U2]以及钙结合能力[1]、降低过敏 性[3]等都有一定程度的改善,但未见对罗非鱼蛋白糖 基化改性的报道。为此,本研究从提高罗非鱼肉蛋白 功能特性的角度出发,选用葡萄糖、乳糖、葡聚糖、 澳门威利斯人88038和壳聚糖作为糖基供体对罗非鱼肉肌 原纤维蛋白进行干热糖基化改性的研究,探讨糖的种 类和改性程度对肌原纤维蛋白溶解性和热稳定性的影 响。
1材料与方法
1.1实验材料
鲜活罗非鱼,体重为(950±15) g,购于湛江市 霞山区步行街肉菜市场,迅速带回实验室。去内脏、 去皮,取其背部白肉切碎备用,凯氏定氮法检测其蛋 白含量(17.80士0.28) %。
1.2实验方法
1.2.1罗非鱼肉肌原纤维蛋白的提取
参照文献[7]的方法,罗非鱼肉分散于3倍体积的 NaCl 溶液(50 mmol/L,含 0.5%的 TritonX-100)中漂 洗10 min,倾去悬浮物。漂洗后的鱼肉于8倍体积的 上述溶液中高速均质2 min,然后用纱布过滤。滤液 冷冻离心(8000 xg,4 °C,10 min),沉淀分散于50 mmol/L NaCl溶液中再离心,重复5次后冷冻干燥即 得肌原纤维蛋白。上述所有操作均在8 C以下进行, 蛋白含量采用凯氏定氮法检测。
1.2.2肌原纤维糖蛋白的制备
肌原纤维蛋白分散于NaCl溶液(50 mmol/L)中, 使其最终浓度为6 mg/mL,糖基化改性对罗非鱼肉肌原纤维蛋白功能特性的影响,然后加入不同种类的糖(蛋 白:糖=1:1,m/m),充分混匀后冷冻干燥。取干粉在密 闭条件(RH=65%,T=50 C)下进行干热反应,120 h 内定时取样。
1.2.3溶解性的测定
参照 Saeki (1997) [8]和 Sato 等(2000) [10]的方 法,干热反应后的混合物定量分散于Tris-HCl缓冲液 (40 mmol/L,pH 7.5,分别含 0.1 mol/L 和 0.5 mol/L 的NaCl)中,高速均质1 min。取10 mL分散均匀的 溶液离心(10000 xg,30 min,4 C),分别检测离心 前分散体系中的蛋白含量和离心后上清液中的蛋白含 量。溶解性用上清液中蛋白质的含量与离心前溶液蛋 白质含量的比值来表示。离心前后溶液中的蛋白含量 用考马斯亮蓝法测定,以考马斯亮蓝G-250为染色剂, 以BSA (Sigma企业)为标准蛋白。
1.2.4 热稳定性的测定
参照Fujiwamk等(1998) [9]的方法。干热反应后
的混合物定量分散于Tris-HCl缓冲液(40 mmol/L, pH 7.5,含 0.5 mol/L 的 NaCl)中,离心(10000 xg, 30 min,4 C)。取上清液80C水浴加热1 h,冰水中 冷却后再离心(12000 xg,30 min,4 C),分别测定 热处理前后上清液中蛋白质的含量。热稳定性用热处 理前后上清液中蛋白含量的比值来表示。
1.2.5 SDS-PAGE 电泳
取适量干热反应后的混合物进行SDS-APGE电 泳分析[11],实验所用浓缩胶浓度为5%,分离胶浓度 为 7.5%。
2结果与讨论
而当反应超过一定时间时,溶解性开始下降。但在整 个实验范围内,改性产物的溶解性均高于改性前体系 的溶解性。如在0.1 mol/L NaCl溶液中,乳糖与肌原 纤维蛋白反应6 h后,产物溶解度从初始的21%提高 到74% (如图lb),而反应120 h后,产物溶解度下 降到34.2%。很显然,随着干热反应的进行,亲水性 的糖基逐渐连接到蛋白分子上,产物的溶解性随之增 大,盐溶性的肌原纤维蛋白在低离子强度溶液中的溶 解性增加,且在高离子强度溶液中仍保持较好的溶解 性;当反应达到一定程度后,美拉德反应进入后期阶 段,蛋白质热变性明显,甚至出现焦化现象,反应产 物的溶解性也随之降低;(2)不同种类的糖与肌原纤 维蛋白干热反应产物溶解性随反应时间变化的程度和 速率不完全相同。葡萄糖和乳糖为糖基供体时,反应 产物的溶解性随反应时间的延长而变化的速率较快, 在实验范围内,反应6?12 h后产物溶解性即达到最 大,而此后随反应时间的延长持续下降;而葡聚糖、 壳聚糖和澳门威利斯人88038为糖基供体的反应产物溶解 性随时间的变化速率相对较慢;比较而言,羧甲基纤 维素钠为糖基供的反应产物溶解性最好,这主要与糖 的分子大小和空间结构有关。在本实验中,葡萄糖和 乳糖属于小分子的还原糖,与蛋白质反应速度较快, 而葡聚糖、壳聚糖和澳门威利斯人88038的分子量较大, 还原性相对较弱,且澳门威利斯人88038的粘度较大,因 此受还原性及空间位阻等的影响,糖基化反应速度较 慢。因此,干热糖基化反应过程中,必须选择合适的 糖,严格控制反应程度,糖基化改性对罗非鱼肉肌原纤维蛋白功能特性的影响,以使体系中蛋白质与还原糖 基的作用尽量控制在美拉德反应的前期阶段。
2.2糖基化反应对罗非鱼肉肌原纤维蛋白热稳定性 的影响
化。由图可知:反应时间对肌原纤维蛋白热稳定性的 影响比较复杂。(1)在实验范围内,葡萄糖、乳糖与 肌原纤维蛋白混合改性的样品反应6 h后热稳定性已 开始下降,此后随着反应时间的延长,体系的热稳定 性略有增加,但总体仍低于未反应混合物的热稳定性, 由此进一步表明小分子还原糖和蛋白质的反应非常 快,产物的颜色褐变非常明显,蛋白质热变性严重, 体系的溶解性和热稳定性都随之下降;(2)葡聚糖和 壳聚糖作为糖基供体时,干热反应产物热稳定性随反 应时间的变化比较缓慢,且总体呈先上升后下降的趋 势。在实验范围内,壳聚糖与罗非鱼肉肌原纤维蛋白 反应72 h后,体系的热稳定性从56.2%提高到75.2%。 但反应达到一定程度后,热稳定性呈现下降的趋势; (3)比较而言,羧甲级纤维素钠作为供体的产物热稳 定性较好,在实验范围内反应24 h后,体系热稳定性 达到80%,与糖的种类对肌原纤维蛋白糖基化反应产 物溶解性的影响相似。当然,在本实验中没有对反应 产物进行分离纯化,对体系测定结果有一定的影响, 各反应产物初始(0h)时的热稳定性就不完全相同, 表明各种糖对体系的热稳定性有一定的影响。综合分 析,预期选择澳门威利斯人88038作为罗非鱼肉肌原纤维 蛋白进行进一步的糖基化改性研究。
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2.3糖基化反应产物的电泳图谱分析 
为了进一步了解干热糖基化反应进行的程度,对 不同种类的糖与罗非鱼肉肌原纤维蛋白干热糖基化产 物进行SDS-PAGE凝胶电泳分析,结果如图3。由图 可知,以葡萄糖和乳糖作为糖基供体的干热糖基化产 物SDS-PAGE图谱基本相似。随着反应时间的延长, 泳动速率下降,反应产物分子量逐渐增大。由此进一 步表明,小分子的还原糖与肌原纤维蛋白反应较快, 随着反应时间的延长,小分子的还原糖与蛋白分子共 价结合,产物分子量增大。而葡聚糖、壳聚糖和羧甲 基纤维素钠作为糖基供体的干热糖基化产物SDS- PAGE图谱基本相似。随着反应时间的延长,反应产 物的泳动速率变化不大,分子量变化不明显,SDS- PAGE电泳图谱只显示肌原纤维蛋白谱带。这也进一 步表明多糖与肌原纤维蛋白的反应速率较慢,反应较 易控制在美拉德反应的前期阶段。其原因可能是受多 糖受分子量、空间结构的影响,还原糖基的作用相对 于葡萄糖和乳糖较弱,反应速度较慢;还有一种可能 就是多糖与肌原纤维蛋白以非共价键(氢键或疏水相 互作用)的形式结合,在电泳样品处理过程中,蛋白 质在户巯基乙醇作用下完全变性,而电泳条带显示的 结果始终都是肌原纤维蛋白。
3结论
小分子的葡萄糖和乳糖与肌原纤维蛋白干热反应 的速度较快,糖基化改性对罗非鱼肉肌原纤维蛋白功能特性的影响,随着反应时间(0~120 h)的延长,糖基 化改性程度增加,SDS-PAGE分析显示产物的分子量 逐渐增大,反应严格控制在美拉德反应前期阶段时, 可以改善产物的溶解性,且在低离子强度溶液中改善 更为明显;大分子的壳聚糖、葡聚糖和羧甲基纤维素 钠与肌原纤维蛋白反应的速度较慢,SDS-PAGE分析 显示产物分子量变化不明显,而反应控制在20 h左右 时,产物的溶解性和热稳定性都能得到有效的改善; 比较而言,澳门威利斯人88038对肌原纤维蛋白溶解性和 热稳定性的改善效果最好。因此,选择羧甲基纤维素 钠作为糖基供体,控制合适的干热反应程度,可以有 效改善罗非鱼肉肌原纤维蛋白的溶解性和热稳定性。
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