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黄原胶发酵动力学的研究

发布日期:2015-02-11 15:36:35
黄原胶发酵动力学的研究
黄原胶发酵动力学的研究,黄原胶是由野生黄单胞菌以碳水化合物为主要 底物,经发酵产生的一种酸性胞外杂多糖[11。
黄原胶分子的基本构成为D-葡萄糖、D-甘露 糖、D-葡萄糖醛酸、乙酸以及丙酮酸w。黄原胶发酵动力学的研究,其中前三者 的比率接近3: 3: 21”。从其分子结构可以看出,主链与 纤维素基本相同,其显著差别仅在于三糖侧链在无水 葡萄糖单位之间交替出现。每两个经由P - 1,4 - D -
糖苷键连接而成的葡萄糖分子上,含有一条由一个 D-葡萄糖醛酸连接两个D-H•露糖组成的侧链,上 面连接有乙酰基和丙酮酸盐
由于黄原胶具存的独特结构141和优良性能15 61,所 以被广泛应用于多种行业中国内外针对黄原胶 研究的工作主要集中在菌种选育、培养基、发酵条件、 基因X程菌构建等诸多方面,f曰.有关发酵动力学的研 究仍少见报道,特别是国内在这一方曲未曾涉足„
发酵动力学研究发酵过程变量在活细胞的作用 下变化的规律,黄原胶发酵动力学的研究,以及各种发酵条件对这些变量变化速 度的影响。在黄原胶发酵动力学的研究中,大家主要 从两个方面进行,即菌体生长动力学和产物合成动力 学。拟通过对这两个过程中微生物比生长速率、基质 消耗率、产物合成率、维持系数等动态变量之关系以 及它们与发酵条件之间关系的研究,从而更加系统、 有效地驾驭这些发酵条件和动态变量,实现发酵过程 中的动力知识题进行了探索性研究,该项基础研究可
用于提卨我国当前黄原胶丁业化生产过程的控制 水平;为改善我国生产的现有黄原胶质量提供了T.程 动力学的调控依据。同时,也为大家后续的基因工程 的黄原胶生物合成代谢谱图及生产工艺放大的研究 奠定了理论基础。
1材料与方法
1.1材料 1. 1.1菌种
Xanthonomas campestris一9002,由本研究室保藏 菌种选育 1.1.2培养基
1.1.2. 1斜面培养基(%)
葡萄糖1.0,蛋白胨1.0,牛肉膏0.15,酵母浸出物
0.3.琼脂2.0,pH7.0。
1.1.2.2种子培养基(%)
葡萄糖1.0,蛋白胨0.5,酵母浸出物0.3,牛肉膏
0.3,硫酸镁0.01,磷酸氢二钾0.05,碳酸钠0.2, PH7,0:
1. 1.2.3发酵培养基(%)
葡萄糖1.0,淀粉3.0,蛋白胨0.3,酵母浸出物 0. 3,氯化钾0. 5,磷酸氢二钾0. 41,硫酸镁0.01,磷酸 二氢钾 0.069,抒檬酸 0.2,PH7.03 1.2方法
1.2.1摇瓶发酵试验
按常规细菌学方法制备种子菌液,以10%的体积 比接人发酵培养基中,并将发酵培养基的最终体积控 制在100ml,装人500ml的二角瓶中,置往复式摇床, 发酵6011(23〇1?111,28尤)(:每个样品设三个重复。 1.2.2发酵罐发酵试验
种子液制备同摇瓶发酵试验。装液量5000ml,接 种量10%,通气量0.6L/min,转速250/min,温度 28 ~3(«:,发酵周期60h,取样间隔4h,PH7.0。检测参 数:转速、温度、粘度、残糖、pH和产胶率3 1.2.3恒化培养
培养基配方同分批培养。恒化培养开始前,先进 行分批培养。培养基经接种后让菌体生长繁殖到一定 的浓度,发酵液粘度达到lOOOOcps以上时,开启蠕动 泵,以某一恒定速率补料,并连续流出样液,保持发酵 罐内液面恒定:当达到稳定状态时,测定各状态参数, 调大流速进行下一组试验。培养条件:28 ± 1^ ,35〇" min,通气量 0. 6L/minn
恒化培养试验装置如图2所示。试验通过进料口
处的两只蠕动泵来调控补料流量,连续从取料n取 料,以维持罐内发酵液体积为一恒定值。
1.2.4发酵液PH值的测定
用PHs -25型PH计直接测定发酵液的pH值。
1.2.5发酵液残糖的半定置测定
产)
1.2.6发酵液粘度的测定
取发酵液直接用上海天平仪器厂生产的- I 型旋转粘度计以叫号转了• 6r/min测定,ffl所得数据 乘以1000即为发酵液粘度5 1.2.7发酵液吸光度的测定
取发酵液稀释后直接用72〖型分光光度计在 650nm波长下测定其吸光度。
1.2,8产胶率的测定
定量称取发酵液,下业酒精沉降.50T烘至恒 1。称最干胶重量,黄原胶发酵动力学的研究,干胶重1与发酵液重量的比即为 产胶率。
1,2,9发酵液残糖的定量测定(3,5—二硝基水杨酸 比色定搪法)丨18]
1,2.10细胞干重的测定
定量汲取发酵液,适当稀释后用事先烘干的滤纸 在大漏斗中过滤,将滤纸置于50?烘箱中烘至恒 重,称重后换算成所需单位。
2结果与讨论
2.1黄原胶分批发酵特性 2.1.1菌体生长曲线
图3为黄原胶分批发酵过程中发酵液吸光度随 时间的变化规律,发酵液吸光度的变化可看作是其中 菌体量的变化,故吸光度随时间的变化曲线可看作菌 体生长曲线,体现发酵过程中菌体的生长情况。从生 长曲线来看,菌体的对数增长期为发酵开始12至 20h,在这一时间内,菌体生长速度最快jOh以后进人
发酵时间[h)
®4黄原胶发酵过程中PH的变化曲线
稳定期,曲线呈平缓趋势,菌体生长儿乎停止。20h后表1。 达到稳定期是因为培养液中菌体繁殖达到平衡。
2.1.2 pH的变化
图4为黄原胶分批发酵过程中pH随发酵时间的 变化曲线3从曲线可看出,在发酵的初始阶段PH值有 一较小的上升,这是因为发酵液中的一些金属盐类及 酸根离子所具有的缓冲作用。之后,因产物合成产酸, pH下降,直至稳定期开始,菌体生长缓慢,pH儿乎不 再发生变化。
于新鲜培养基的加人造成局部浓度现象的发生=发酵 罐的工作体积确定为8L(其装量系数为〇. 625)「综合 工艺要求,选择搅拌转速为35〇r/min,培养温度为 通气童〇. ^L/min。连续培养补料葡萄糖溶 液浓度为30g/L„
2.3恒化培养稳定状态的确定
根据发酵液粘度及pH的变化进行判断,当粘度 和pH在一较长时间内维持稳定时,间隔〗~ 2h取样 测其粘度,并观察pH变化,若2 - 3次无变化或变化 很小,即认为系统已达稳定状态。
2. 4连续培养试验结果
按上述实验条件和要求,以葡萄搪作为限制性基 质进行连续培养先进行分批培养,并在24h以相对 于发酵液1%的量补加葡萄糖一次。当发酵液粘度升 至]8500cps时开始连续培养。稀释率试验范围为 0.03-0. 08h_\当每改变一次稀释率,进人稳态后分 别取样测定残糖、菌浓、粘度和产胶率。试验结果列于
由表1可见,菌浓、产率、粘度、pH均随稀释率增 大而降低。这是因为发酵液浓度变稀所致。不同稀释 率下的各参数计算值见表
表1恒化培养试验数据
稀释速率D/(f)菌浓(g/L)残糖(g/L)粘度{cps)pH产率(%)
0.0335.27. 830139006.352.36
0.0432.611.1188006,051.54
0- 0530.214.7053005.901.46
0.0627,019-0138005.861-22
a 〇819.831.2535005-911.12
表2不同稀释速率下各参数的计算值
rnh-1)Yc(g/g)DX(g/L h)Qo^g/g. h)
0.030. 02741.0941.06a 0020
0,040. 0354L 1281.300.0021
0.050.04191. 1941.510.0024
0.060. 04661,2861.620. 0027
0.080.03542. 2631.580. 0045
其中;Qr. = D(S。- S)/X为底物葡萄糖比消耗速率.g/f;. h; Yc =- S),为基质得率系数,以以D/X,为黄质K比生成速
率j/g;. h;DX为菌沣生长速軋g/L上
2.2培养条件的确定所致。
恒化培养要求发酵罐内培养液混合均匀,防止由2.5—9902生长模型的建立
由表2可知,随着稀释率的增加,基质得率和 产物比生成速率都呈上升趋势,黄原胶发酵动力学的研究,这说明连续补料可 提高基质得率,促进产物生成。而底物比消耗速率 和菌体生长速率均增加到一定程度后有所下降,这 是由于体系被稀释一定程度后菌体生长平衡被打破
0 111''
0.030.040.050.060.08
稀释率(1/h)
+残.+茴浓+产率一•_粘度
图,不同玀释速率T的稳态蒗浓、产胶率、残糖、粘度
及发酵动力学特性参数的推导
图5显示野油菜黄单胞菌连续培养达稳态时菌 体浓度、黄原胶产率、发酵液粘度、残糖含量随稀 释速率D的变化关系,从图中可以看出,随D的提 高,菌体浓度、发酵液粘度和产率均下降。由于葡 萄糖料液流人体系后有三个流向,一为菌体生长消 耗,二为产物合成消耗,其余随发酵液流出。故葡 萄糖料液的不断补加使体系稀释,上述参数下降, 残糖含量增加。
已知 Monod 方程S/(fe+S)⑴
变形得 1/(1 = 1/和„ + Ks/p™,. 1/S⑵
稳态时P = D,故l/)x可以1/D来代替。
由图2-4可见l/>ftl/S成直线关系,说明野 油菜黄单胞菌的生长与限制性基质浓度的关系符合 Mum>d方程。根据连续培养试验结果,用计算机对1/ M•和i/s进行最小二乘回归,求得jw=o. ism-1, L = 41. 32g/L(其相关系数 R = 0. 9995)。
在连续培养中,对底物葡萄糖进行物料衡算,可 以得到基质的比消耗速率与菌的比生长速率^最 大生长得率系数Yc™'和维持系数m的关系式如下:
Q& = II/YG0"1 + tn(3)
拫据式(3),通过计算机对和p进行线性回归 |由于稀释率为a 〇8时体系已被破坏,故作图时舍去 该点),求得 YGm!U = 1. 560g/g 和 m = 0. 009g。
2.6服咖,? c£iwi/)€sfris—9902 比生长速率对菌
体产率的影响
由Mnnod方程变形得3口皡,,/(卜-^)(4)
因「) = [1,所以 S = DKV(p^-D)(5)
g0.5 .
〇11111
00.020.040.060.089,1
K-ll/h).
囝7比生长速率叫与菌体产串DX的关系
稳态时,对限制性养分葡萄糖进行物料平衡可求
X = Y(SU-S)(6)
将式5代人式6得
X = YX/5[S〇-DK5/(JI„„-D)](7)
DX=DY1/5|S〇-DK5/((j..„-D)l(S!
为求得DX达到最大值时的D
d(DX)/dD=0(9)
解方程(8)和(9),并假设Y.x/S不受D的影响,则 D = D. = )L.„[I - (K./fKs + So))1'-'](10)
将(!■_=0. 18901T1,K,=4].32s/I.,S〇=40g/L 代人式(10)得最适理论稀释速率D„ = 0. 05428h -1。
图7为DX随A而变化的曲线,曲线呈钟罩形,由 计算所得最佳理论稀释速率与曲线峰值逼近,黄原胶发酵动力学的研究,说明理 论值与试验结果相符3曲线与横坐标D为0时的交点 0. 1684和计算所得最大比生长速率0. ]890较为接 近,进一步证明了试验的正确性
3结论
通过对黄原胶发酵动力学的研究.得知分批发 酵过程中菌体对数增长期为12~20h PH随发酵时 间先小幅度增加,后下降,对数增长期后平缓。1/|X 与1/S符合Momjd方程,得出最大比牛长速率 (x„„=0. I890h'饱和常数K.=4〖.32g/L,基质得
率系数二〇, 〇62g/g,维持系数m = 0」543g/ g,h,最佳理论稀释速率Dtn=0,0M28h_1。随稀释 速率增加,粘度、菌浓、产胶率下降,残糖上升。
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