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黄原胶降解及其抗氧化性能研究

发布日期:2015-03-13 15:23:48

黄原胶降解及其抗氧化性能研究和氧化降解

黄原胶降解及其抗氧化性能研究,酸性条件下对黄原胶进行氧化降解,透析得到两种黄原胶寡糖,对产物进行FT-IR表征,GPC法测定两 种寡糖的分子量分别为7500、10100。考察两种产物对超氧阴离子自由基〇;•和过氧化氢的清除活性以及还原 能力,结果表明10100-XG较7500-XG具有更强的抗氧化性能。这可能与黄原胶寡糖活性轻基数目有关。

生物体内自由基处于不断产生与清除的动态平 衡中。一旦自由基产生过量或者机体清除自由基的 能力减弱,就会造成自由基的代谢失衡。许多疾病 与自由基的代谢失衡导致的生物大分子损伤有关, 其中活性氧如超氧阴离子自由基与癌症、糖尿病、心 脑血管疾病等密切相关⑴。因此研究和寻找外源 性自由基清除剂保持机体自由基代谢平衡具有重要 意义。目前,已发现多种微生物多糖具有抗氧化活 性。黄原胶在1952年首先由美国农业部从野油菜 假单胞分离得到,因其优良的理化性能而被广泛关 注[2]。目前国内外对于黄原胶的研究主要集中在 发酵提取及理化性能方面,对其生物活性的研究较 少。
黄原胶分子量大,溶解性能差,刚性双螺旋结构 将活性基团包围在内部[3],黄原胶降解及其抗氧化性能研究,限制了其生物活性,故 需对其进行改性,其中降解是改性的重要手段之—[4],降解后的黄原胶具有一定生物活性[5]。本文 采用氧化手段对黄原胶进行降解,考察两种不同分 子量黄原胶寡糖的抗氧化活性,以期为黄原胶进一 步开发研究提供思路。
1实验部分
l.i材料
黄原胶(食品级,上海联合食品添加剂有限公 司);鲁米诺、DPPH(Sigma企业);其余试剂(均为分 析纯,上海化学试剂企业);抗氧化测试所需溶液, 由二次蒸馏水配制。
WFZ UV2000型紫外分光光度计(上海合利仪 器有限企业);Delta 320型pH计(梅特勒一托利多 仪分析仪器上海有限企业);IFFM-D型流动注射化 学发光分析仪(西安瑞迈科技有限企业);JB90-D型 强力电动搅拌机,METTLER AE200型电子分析天 平,JI80-2B型台式离心机。
1.2黄原胶降解产物制备
将36 g黄原胶(XG)溶于2000 mL浓度为0. 4 mol/L的HCI溶液中,向其中加人50 mL 30% H202,于 80 t 下降解 5d,冷却,用 0. 2 mol/L NaOH
调节溶液pH至7,先通过微孔过滤器过滤(〇. 45 jwn),然后在蒸馏水中透析(7000,14000)6 d,冷冻 干燥后分别得到两种黄原胶寡糖(A,B)各约1.0 g。 1.3测试表征
红外光谱在EQUNOX55傅立叶红外-拉曼光谱 仪上进行,采用KBr压片法制样,测定波数范围为 400 ~ 4000 cm1,分辨率为 〇• 8 cm—10
采用GPC法测定黄原胶降解产物的相对平均 分子质量及其分布。GPC测试条件如下:柱子: TOSOH BIOSEP G4000SWXL;流动相:0.2 M 醋酸钠 溶液;色谱仪:Waters 515型凝胶色谱仪;检测器: Waters 2410示差折光检测器;进样量:50斗;柱温: 40弋。标准物质为:葡聚糖,分子量分别为473000、 188000、76900、43200、10500。
1.4抗氧化性能测定
1.4.1对超氧阴离子自由基〇;•的清除
采用邻苯三酚-鲁米诺化学发光体系来检测 〇;• [6],配制 pH = 10. 20 的 0. 5 mol/L Na2C03-NaH- C〇3缓冲溶液。并以此缓冲液作为溶剂配制1.5 x 10_3 mol/L的鲁米诺溶液以及不同浓度的样品溶液, 用1 x 1(T3 m〇l/L的盐酸配制浓度为〇. 1 m〇l/L的邻 苯三酚储备液,使用前用去离子水稀释至浓度为1 x 104 md/L。用流动注射化学发光分析仪依次测 定从稀到浓的样品溶液(缓冲液为空白溶液),读出 峰面积,试验重复三次。并按下式计算样品溶液对 0;•的清除率:清除率= (A。-AJ/A。X100%。式 中:A。一空白溶液峰面积Ai—样品溶液峰面积 1.4.2对过氧化氢的清除
配制 pH =7.20 的0• 2 mol/L Na2HP04-NaH2P0 缓冲溶液。取7支比色管,分别加人浓度为0. 1 mol/L的H202溶液(磷酸盐缓冲液配)、不同浓度 样品溶液各2.0 mL。充分摇勻后于33弋避光静置 半小时,在230 mn处测量吸光度。空白组以去 离子水代替样品溶液测定A〇,对照组以磷酸盐缓冲 溶液代替H202溶液测定试验重复三次,并按 下式计算样品溶液对过氧化氢的清除率:清除率=
[1 -(Ai -A^/Ao] xl00%
式中:A。一空白组吸光度不同浓度样品溶 液吸光度Af对照组吸光度 1.4.3还原能力的测定
还原能力测定根据文献[7]进行并稍做改动,具 体操作为取8支比色管,分别加人pH =6. 60的0.2 mol/L磷酸缓冲液、1%铁氰化钾溶液各2.5 mL,然 后向每根管其中加人不同浓度样品溶液2.0 mL。 充分混勻后于50 T水浴20 min,取出后马上置于冰 水中冷却,然后加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液,混 勻后2000 r/min下离心10 min,另取8支比色管, 取离心后上层清液2.0 mL并加人去离子水2. 5 mL 和重新配制的〇. 1%的三氯化铁溶液0• 5 mL,静置 十分钟,以去离子水为空白对照,于700 rnn处测定 吸光度。吸光度的增强表明还原能力的增强。
2结果与讨论
2.1原料黄原胶及其寡糖的结构表征
图1是原料黄原胶(XG)以及黄原胶寡糖(A、 B)的红外光谱图。由图可知,黄原胶降解及其抗氧化性能研究,酸性条件下氧化降解 得到的两种分子量寡糖均保留了黄原胶的特征吸取 峰[8],即2920 cm—1处-CH2伸缩振动吸取峰;1623 cm'1处丙酮酸酯中-C = 0伸缩振动吸取峰;1418 cm“处羧酸盐中-C-0伸缩振动吸取峰及894 cm'1处 沒-吡喃糖环中C1-H弯曲振动吸取峰,这表明降解后 的黄原胶基本结构单元未被破坏。XG的-0H伸缩 振动吸取峰出现在343601^处,而A和B的伸缩振 动吸取峰分别出现在3408 cm4和3417 cnf1处,表明 降解后的黄原胶寡糖形成了更多的分子内或分子间氢 键,这可能是由于降解使得更多轻基暴露出来[9]。
GPC测试结果表明:两种黄原胶寡糖A、B相对 分子质量分别为7500和10100。
2.2抗氧化性能测定
2.2.1对超氧阴离子自由基〇2•清除
超氧阴离子自由基是所有活性氧自由基中的第 一个自由基,它具有重要的生物功能和与多种疾病 有密切关系。图2描述了不同分子量的黄原胶寡糖 (7500-XG和10100-XG)对超氧阴离子〇2•清除效
果。它们对超氧阴离子0;•的清除活性随着浓度的 升髙而逐渐增强,其半抑制浓度1(^ (对自由基清除 率为50%时所需要的自由基清除剂浓度)分别为〇.貶 和0.36 mmol/L。即对超氧阴离子清除能力为:10100- XG >7500-XG〇在该体系中,抗坏血酿搁氧阴离子自 由基(V的半抑制浓度IQ为0.191mmol/L。
2.2.2对过氧化氢的清除
过氧化氢按结构划分不属于自由基范畴,但其 在人体内的损伤作用和自由基类似,并能够形成毒 性最大的轻基自由基,引发细胞膜中的不饱和脂肪 酸发生过氧化反应,从而产生危害,因此在自由基损 伤研究中过氧化氢也被算作一种自由基[1°】。图3 描述了两种不同相对分子质量的黄原胶(7500-XG 和10100-XG)对过氧化氢的清除效果。它们对过氧 化氢的清除活性暉着浓度的升高而逐渐增强,其对 于过氧化氢的半抑制浓度ICM分别为〇. 19和0. 09 mmol/L。即对过氧化氢的清除能力为:l〇l〇〇-XG > 7500-XG。在该体系中,抗坏血酸对过氧化氢半抑 制浓度 IQ为 0.0030 mmol/L。
2.2.3还原能力的测定
还原能力是表示抗氧化物质提供电子能力的重 要指标。研究表明抗氧化活性和还原能力之间存在 着密切的关系[11]。图4描述了不同分子量黄原胶 寡糖(7500-XG和10100-XG)的还原能力。由图可 知,随着浓度的增加,样品的吸光值也随之增加,还 原能力逐渐增强。在0.4 mmoI/L时,其吸光度分别 为0.06和0.27,即还原能力为:10100-XG >7500- XG。在相同体系下,抗坏血酸浓度为〇.4 mmol/L 时,吸光度为1.06。
综上所述,两种黄原胶寡糖对超氧阴离子自由 基〇;’黄原胶降解及其抗氧化性能研究,和过氧化氢的清除活性以及还原能力的强弱 为:10100-XG > 7500-XG。黄原胶结构中含所有大 量轻基可能是其具有抗氧化活性的主要因素[12]。 黄原胶结构结构单元的分子量是900,其中含有11 个羟基。黄原胶的降解主要由主链葡萄糖链断裂引 起,羟基含量基本保持不变[13]。故一个7500-XG分 子平均含有92个羟基,而一个10100-XG分子平均 含有123个轻基。由此可知,10100-XG的羟基含量 较高,这可能是导致其对超氧阴离子自由基02•和 过氧化氢的清除活性以及还原能力较强的主要原 因,相关机理还有待进二步研究。
3结论
在酸性条件下氧化降解黄原胶,经过透析,筛选 出两种不同分子量的寡糖,抗氧化性能测试表明, 10100-XG >7500-XG,这可能与黄原胶寡糖肝羟基含 量有关。本研究为黄原胶寡糖进一步的改性接枝提供 依据,为黄原胶的功能做用研究《^益的参考。
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