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黄原胶降解菌的筛选及其降解酶性质的研究

发布日期:2015-03-15 21:44:35

黄原胶降解菌的筛选及其降解酶性质的研究和黄原胶降解菌

黄原胶降解菌的筛选及其降解酶性质的研究,从野外采集并筛选到一株能降解黄原胶的菌株,并对菌种进行了对照鉴定。此外, 对菌株的发酵参数、黄原胶降解菌的性质(最适反应温度、pH值,金属离子的影响、底 物专一性、动力学研究等)作了初步的研究。结果显示,该酶的最适催化反应温度和pH 分别为30t~4(n:和5.0?7.0;能够专一性降解黄原胶;测试大多数金属离子对酶活力没 有明显影响,但Ca2+能很大程度地缓解EDTA对酶活的抑制作用。

黄原胶由五糖单位重复构成,其主链是由P-1,4-糖苷键相连的葡萄糖链组成,在 主链结构上每隔一分子葡萄糖连着一个由三糖组成的侧链:甘露糖—葡萄糖^甘露糖。 其中,与主链相连的甘露糖大多被乙酰基和侧链末端的甘露糖与丙酮酸发生缩醛反应从 而被修饰,而中间的葡萄糖则被氧化为葡萄糖醒酸,分子量一般在2000 ~2_kD之间。 黄原胶除了有规则的一级结构外,还具有稳定的二级结构——规则的螺旋结构[1]。
黄原胶(xanthan gum)是人类研究最深、商业化应用程度最高的微生物胞外多糖。 由于其独特的剪切稀释性质,良好的增稠性,理想的乳化稳定性,对酸、碱、热、反 复冻融的高度稳定性以及对人体的完全无毒害等许多优良的特性,而在食品、石油、 医药、日用化工等十几个领域有着极其广泛的应用。超乎寻常的稳定性极大地扩展了 黄原胶的应用范围,但同时也引起了一些应用问题。采油过程中黄原胶的使用可提高 采油率,但也增加了原油的粘度,使后续工艺如油料运输及产品纯化的成本增高[2], 为此需要能方便降解黄原胶的方法。
尽管黄原胶的主链结构与纤维素相同,但由于规则的螺旋结构的保护,以及侧链 所产生的位阻,使得一般的糖水解酶如淀粉酶、纤维素酶和半纤维素酶等都很难将其 降解[3]。Rinaudo等在1980年第一次报道了用纤维素酶可以降解不规则构象的黄原胶 主链,但却几乎完全不降解具有规则的螺旋构象的黄原胶[4]。为了能有效降解黄原胶, Cripps等人于1981年从土壤中分离到一种能以黄原胶为唯一碳源进行生长的棒状杆 菌[2],随后陆续又有研究者又发现了黄原胶的降解菌株[5’6]。
最近大家从土壤中首次分离到了一株能够使黄原胶粘度迅速下降的 菌,该菌能够以黄原胶为唯一碳源进行生长,并发现该菌具有胞外黄原胶降解酶活性。 本文主要研究了该黄原胶降解菌株的分类及降解酶的性质,这也是国内首次有关生物 降解法生产黄原胶寡糖的报道。
1材料与方法
1.1黄原胶降解菌株的筛选及鉴定
将土样悬浮于灭菌后的生理盐水中,并进行梯度系列稀释后,按常规方法涂黄原 胶平板,于30丈培养箱中培养24 h。分别挑出单个菌落的一部分接种于黄原胶平板, 于30T培养箱培养24 h,作为保留菌种;另一部分接种于选择性液体培养基,并于 30丈振荡培养(20〇r/min),观察培养基的粘度变化。
选择性液体培养基组成为:黄原胶:2.5 g, (NH4)2S04 0.5 g, KH2P04 3.0 g, K2HP043.0 g, MgS04 • 7H20 0.2 g, FeCl3 • 6H20 16.7 mg, CaCl2 • 2H20 0.66 mg, ZnS04 • 7H20 0. 2 mg, CuS04 • 5H20 0. 2 mg, MnS04 • 4H20 0. 2 mg, CoCl2 • 6H20 0. 2 mg,H3B03 0• 1 mg, NaN03 2. 0 g,Na2Mo04.2H20 0. 3 mg,定容至 1 L。黄原胶平板 培养基的组成为:琼脂粉:20 g,蛋白胨:1 g,酵母浸出粉:1 g,黄原胶:3 g,葡萄 糖:2 g,水:1 L。黄原胶液体培养基的组成为:黄原胶:4.5 g,葡萄糖:0.8 g,蛋 白胨:1 g,酵母浸出粉:1 g,调pH至7.0左右,定容至1 L。
黄原胶降解菌株的分类鉴定按《伯杰细菌鉴定手册》[7]和《国际细菌分类学杂志》 进行。
1.2培养
将活化后的黄原胶降解菌按1 %接种量接种至装有100 mL黄原胶液体培养基的250 mL三角瓶中培养。培养温度为30丈,旋转式摇床转速为200 r/min,培养过程中每间 隔一定时间取样,分别测定发酵液的和上清液中的还原糖含量(P-Hydroxybenzoic acidhydrazide, PAHBAH 法[9])及粘度。
1.3降解酶的初步纯化
将培养4 ~5 d的发酵液(以培养液的粘度大幅度降低为根据)在9, 000 r/min, 条件下离心15 min除去菌体,于上清液中分别加人35% ~ 80%不同饱和度的 (冊4)2304,静置4〇111丨11,然后在900〇1'/111;11,4丈下离心2〇111111,用磷酸盐缓冲液溶解 沉淀,分别测定酶活力。
将盐析后所得粗酶透析12 h (换3次透析液),冷冻干燥后,再溶解于小体积的相 同缓冲液中。上事先平衡过的DEAE-Sepharose柱(pH = 5. 9),用含有0. 7 mol/L NaCl 的相同缓冲液线性梯度洗脱(流速1 mL/min),并收集活性组分。合并活性组分并透 析后,用冷冻干燥机浓缩,再次上DEAE-Sepharose柱(pH =4. 9),收集活性组分,透 析12 h (中间换3次透析液),浓缩成固体后-20T冷藏保存留作活性分析。
1.4酶活力分析
将一定量的酶与底物(0.25%黄原胶水溶液)混合后(酶与底物的质量比为1:15), pH5.9,在30丈水浴中反应45 min,马上取200 JJLL反应液加入到750 JJLL5%PAHBAH (汾81^)和他〇11(5%)的混合液中,在12〇<€下加热15 111;11,用酶标仪测定01>4〇5。
黄原胶降解酶的活力定义为每分钟催化形成相当于1 ^mol葡萄糖的还原末端所需 的酶量为一个酶活力单位。
1.5黄原胶降解酶的酶学性质研究
1. S. 1温度对黄原胶降解酶的影响:分别在25T、30T、35丈、40T、50T下测定酶 活(PH5.9),以30丈为基准(100%)。并在40^,45T, 50T下分别保温1 h,在 30T水浴中测定酶活,以没有保温Oh的酶活为基准(100% )。
1.S.2 pH对降解酶的影响:分别在pH 4.4、4.9、5.9、7.0、8.0、9.2下于30弋水 浴中保温〇、1、3 h,测定酶活,以在PH5.9下保温Oh的酶活作为基准(100%)。 1.5.3金属离子对酶活的影响以及Ca2 +对EDTA抑制作用的补偿:在不同金属离子存 在时测定酶活(3(TC, PH5. 9),以没添加金属离子的酶活作为空白对照(100%),除 Na+和K+为150 mol/L外,其余的金属离子浓度皆为1 xl(T3m〇l/L。
在EDTA存在下(6xl(T4m〇l/L),加人不同量的Ca2+,测定酶活,以不含EDTA 和Ca2+的酶活为空白对照(CK,100%)。
1.5.4底物专一性的研究:分别以纤维素、淀粉、葡聚糖、木聚糖、昆布多糖、卡拉 胶(T),卡拉胶〇〇,卡拉胶(K)[以上药品皆为Sigma企业产]作为酶解底物,以 黄原胶作为底物的酶活为基准(1〇〇%),测定酶活(30^,PH5. 9),以上黄原胶作为 底物的酶活为基准(1〇〇%)。
1.5.5酶的动力学研究:(a) V-S曲线:将一定量的酶与不同浓度的底物(S)混和, 酶解时间准确控制为15 min (3(rC, PH5. 9),测定还原糖的生成量,除以酶解时间作 为酶解速度(V^以V-S作图。(b) EDTA对酶活的抑制曲线:将一定量的酶与不同 浓度的底物(S)混和,加人EDTA,使其在反应体系的浓度为lxl(T3m〇l/L,酶解时 间准确控制为15 min (30丈,PH5. 9),测定还原糖的生成量,除以酶解时间作为酶解 速度(V),以V-S作图。
2结果与讨论
2.1菌株的筛选与鉴定
从黄原胶平板上挑取能使选择性液体培养基粘度明显变稀所对映的菌落,在新鲜 黄原胶平板上划线培养,选择单菌落,用选择性液体培养基进行复筛,经对培养过程 中培养液粘度下降程度和速度的比较,选出一株对黄原胶降解能力最强的菌落作为研 究用菌,并命名为XT11。
黄原胶降解菌XT11在细胞生长过程中呈杆状,老龄菌为球形,黄原胶降解菌的筛选及其降解酶性质的研究,菌体形态不规则; 不形成孢子,革兰氏染色阳性,抗酸性阴性,且不运动。由《伯杰细菌鉴定手册]可 知,应属于纤维单胞菌属但由于其不水解纤维素,又与已知纤维单胞菌 属的各个种有区别,可能是属中的一个新种。有关该菌株是否是一新种, 尚需对其16S rRNA系统发育树和DNA杂交数据分析后才能确定。
2.2发酵
将黄原胶降解菌XT11接种于黄原5.(^
胶液体培养基中培养,并测定培养过程丨
中的细胞浓度、还原糖含量和粘度的变3.5 - 化,结果如图1。当有还原糖(在发酵 液中加人了少量的葡萄糖来加快菌株的|g ^ - 最初生长速度),存在时发酵液的粘度
没有变化,说明没有降解酶的出现。发 酵2d后,发酵液中的葡萄糖耗尽,该 菌株开始分泌降解酶降解黄原胶(现象 反映为还原糖的生成以及发酵液表观粘 度的下降),因此有明显的二次生长现 象,并断定该酶为诱导酶。此外,发酵
液中还原糖的大量生成滞后于发酵液粘度的大幅降低,说明最先被降解的应是主链结 构(xanthase),伴随的还原糖量持续升高则说明了发酵液中侧链降解酶(xanthan lyase)的存在。
2.3黄原胶降解酶的部分分离纯化
黄原胶降解酶分离纯化的结果如表1。经测定,45% ~65%饱和度的硫酸铵可以最 大限度地将黄原胶降解酶沉淀并除去尽可能多的杂蛋白。
表1黄原胶降解酶的纯化结果
提纯步骤总酶活/ (u)总蛋白量/ (mg)比活/ (u/mg)回收率/ (%)提纯倍数
Crude enzyme348111231.71001
(NH4 ) 2 SO4 Precipitation2054105.319.559.011.5
DEAE-Sepharose ( pH5. 9 )
Chromatography16263.3348.446.728.5
DEAE-Sepharose ( pH4. 9 )
Chromatography ( peak 1 # )214.30.73293.56.2172.6
DEAE-Sepharose ( pH4. 9 )
Chromatography (peak 2#)333.70. 86388. 19.6228.3
在硫酸铵沉淀蛋白中仍含有相当量的糖,由于这些糖并不挂柱,因此在第一次DE- AE-Sepharose层析时(pH5_ 9)可将其除去。在第二次DEAE-Sepharose柱层析时 (PH4. 9),从柱上洗脱出两个具有酶活的蛋白峰(分别命名为峰1#和峰2#,图略)。 由黄原胶的结构推测,微生物要利用黄原胶作为碳源生长,至少应由两种酶共同起作 用——主链水解酶和侧链水解酶,因此推测这两个蛋白峰可能为两种不同的降解酶, 有待进一步的实验证实。至投稿日止,大家尚未得到电泳纯的黄原胶降解酶,因此本 文使用部分纯化的黄原胶降解酶进行酶学研究。
2.4酶学性质的研究
2.4.1最适酶解温度以及温度稳定性:结果表明(图2),黄原胶降解酶的最适温度为 30^~40^,并且,其温度敏感性较高,在45^下保温lh酶活力是28.6%, 50^下 保温1 h酶活力只剩14. 6%。 2.4.2最适酶解PH以及pH稳定性:见图3。该酶的最适PH的范围为5.0?7.0,但 对pH的敏感性不高,在PH9. 2时能保持57%的活性,即便在此pH下保温3 h能保持 43%的活性。
金属离子对酶活的影响:由结果(图4)可知,主族的二价离子Ca2+、Mg2+对
酶活没有影响,高浓度的主族一价离子Na+、K+对酶活有一定程度的影响,过渡金属 离子Co2 +对酶活有一定的影响,而过渡金属离子Hg2+、Zn2+、金属离子螯合剂EDTA 的存在则几乎可使其完全失活。而由Ca2+对EDTA抑制作用的补偿实验结果(图7) 可知,Ca2+能很大程度地缓解EDTA对酶活的抑制作用。
图4金属离子对酶活的影响图5 Ca2 +对酶活的补偿作用
可由此推测出主族的二价金属离子(如Ca2+,Mg2+等)对于维持此酶活性的必要性: 一是直接的活性中心,二是作为辅基而起辅助性作用。正常情况下此酶中并不缺少此 类金属离子,因此Mg2+和Ca2+的加人并不能影响酶活,而加人EDTA后,由于其螯合 了酶中的此类金属离子而使酶活大幅降低,通过向溶液中添加Ca2+可使酶活得以恢复。 而就主族的一价金属离子、过渡金属离子而言,黄原胶降解菌的筛选及其降解酶性质的研究,由于对酶中的金属离子存在着竞争而 将其置换下来,从而导致酶活力不同程度的损失。
2.4.4底物专一性的研究:黄原胶降解酶具有髙度底物专一性,除黄原胶外,对其它 多糖仅有较低的降解活性,如表2所示。
表2酿的专一性研究
底物相对酶活/%底物相对酶活/%底物相对酶活/%
黄原胶100昆布多糖0果胶0
纤维素9卡拉胶(T)0岩藻聚糖4
淀粉0卡拉胶0023海藻酸钠10
葡聚糖0卡拉胶U)5菊粉0
木聚糖0瓜胶18多聚半乳糖醛酸12
2.4. S酶的动力学研究:米氏方程以及EDTA对酶活的抑制作用:如图6,通过绘出 V-S曲线,可得到关于此酶的如下信息:(1)米氏常数(Michaelis constant) &n = 0.26|xg/mL; (2)最大反应速度Fmax=72(jimol/ (min*g);因此,如果该酶的动力学 方程符合 Michaelis - Menten epuation,则:
(a)当 S< </:m时,V = VWxS/Xm=277 • S
(b)当 S > 时,V = Fmax =72 (junol/ (min . g)
(c) 当 S与接近时,V = Fmax/ (尺m+S) =72/ (0.26+S)
通过有EDTA抑制时的V-S曲线可以看出,EDTA使酶对底物的/Cm明显增大(K„ >XJ,而并无太大变化,说明EDTA可能螯合并从而占据了酶和底物的结合作用 密切相关的金属子的位点,黄原胶降解菌的筛选及其降解酶性质的研究,使得酶与底物结合的能力大大减弱,只有当底物浓度过量 时,才能恢复其原有的反应速度。此外,如很多构酶那样,抑制剂(EDTA)的存在增 大了底物(黄原胶)与酶结合过程中的协同性,使V-S曲线变为明显的S型,因此推 测此酶为别构酶。
S/( 11 g/mL)
图6无抑制的V-S曲线以及加人EDTA后的V-S曲线
3结论及展望
本文发现了一种新型的可分泌黄原胶降解酶的细菌,并对该酶进行了初步的分离 纯化;研究了黄原胶降解酶的酶学性质,发现黄原胶降解酶对温度敏感性较高,而对 pH环境的要求则相对宽松;通过研究金属离子对酶活性影响,以及Ca2 +对EDTA抑制 作用的补偿作用,推测有二价的主族金属离子作为辅助因子对酶的活性起作用;通过 研究酶反应初速度(V)与底物浓度(S)之间的关系,以及加人抑制剂后的V-S关系 发现,此酶为别构酶。而由该酶降解黄原胶所得到的寡糖的结构、组成以及可能拥有 的生物活性,有待进一步的实验研究。
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