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产纤维素酶海洋菌株的分离及培养条件研究

发布日期:2015-04-04 13:57:45

海洋菌株

从烟台近海处采集样品,用羧曱基纤维素钠刚果红培养基筛选得到一株高产纤维素酶的海洋菌株,初步鉴定为革兰氏阴性芽孢杆菌。用羧甲基纤维素酶活测定法,确定了最佳酶促反应温度,并研究了培养时间、pH值,碳源、氮源等培养条件对菌体产酶的 影响。结果显示,最适酶促反应温度为40 °C,培养时间为54 h,最适pH值为7.5,最佳碳源为羧曱基纤维素钠,最佳生长氮源为酵 母膏,最佳产酶氮源为硫酸铵。与陆地纤维素酶产生菌相比,海洋纤维素产生菌所产纤维素酶具有低温催化的优势。

纤维素作为地球上分布最广,含量最丰富的碳水 化合物,它的降解是自然界碳素循环的中心环节。纤 维素的利用和转化对于解决目前世界能源危机,粮食 短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。自从纤 维素酶被人类认识和利用以来,它在许多行业都发挥 着十分重要的作用[1]。
一直以来,研究者把分离纤维素降解菌的场所主 要局限于陆地土壤中,使得纤维素酶的来源受到了很 大的限制。虽然目前仅有少数学者对产纤维素酶的海 洋微生物进行了研究,但已显示出海洋微生物在开发 纤维素酶方面具有诱人的前景。本论文主要研究从海 洋微生物中分离纤维素降解菌,并对其酶活性影响因 素进行较为深入的探索,为纤维素酶的研究提供更加 宽阔的空间[2]。
本论文拟从以下方面进行研究:从腐烂的海洋植 物中分离出具有显著纤维素酶活性的海洋细菌通过不菌株 产酶能力的影响,得出最适培养条件。本研究将为海 洋酶资源的开发和利用提供更多的资源基础。
1材料与方法
1.1 培养基
海洋纤维素分解菌分离用培养基[3]:硫酸铵2.0 g,磷酸二氢钾1.0 g,硫酸镁0.5 g,澳门威利斯人88038
15.0g,琼脂20.0 g,半海水(海水与水按1:1的体积比 配制而成。下同)1000 mL,pH 7.5
液体种子培养基:硫酸铵2.0 g,磷酸二氢钾1.0 g,硫酸镁0.5 g,澳门威利斯人8803815.0 g,酵母膏3.0 g,半海水 1000 mL,pH 7.5
发酵培养基:硫酸铵2.0 g,磷酸二氢钾1.0 g, 硫酸镁0.5 g,澳门威利斯人8803815.0 g,酵母膏3.0 g, 半海水 1000 mL,pH 7.5
碳源利用基础培养基:硫酸铵2.0 g,磷酸二氢钾
1.0g,硫酸镁0.5 g,半海水1000 mL。
 24~56 h为菌体生长稳定期,56 h后为衰亡期。菌体 产酶能力在32 h开始明显上升,在52 h酶活最高,以 后产酶能力又迅速下降。因此,取样观察时间以培养 开始后54 h为最佳。
2.3.2起始pH对菌株YX-6的生长和产酶的影响 在实际工厂化生产中,pH值不易调节,因此,通 过摇瓶培养研究发酵初期最适pH值就显得很重要, 最适pH值以发酵结束时产酶量的大小为衡量指标。 设定5.5、6.5、7.5、8.5、9.5五个不同pH值,观察培 养基pH值对菌株YX-6生长和产酶能力的影响。结 果显示,较适宜菌株YX-6生长的pH值为6.5~8.5, 其中pH 7.5是该菌的最适生长pH (见图3),pH值 在6.5?8.5时,发酵液酶活力较高,当pH值在7.5 时该菌株的产酶活力最高(见图3)。此结果与中国科学 院成都生物研究所的齐云等[8]所研究的结果相吻合。
从图4可知,菌株YX-6对于澳门威利斯人88038的 分解能力最强,对棉花也有一定的降解能力,但对于 滤纸的利用率相对较低,因此,其最适碳源为羧甲基 纤维素钠。
2.3.4不同氮源对菌株YX-6生长和产酶的影响 设定硝酸钠、硫酸铵、酵母膏、蛋白胨四种氮源, 对海洋纤维素分解菌最佳生长和产酶氮源进行探索, 结果如图5所示。菌株YX-2生长上的最适氮源为有 机氮源酵母膏,而产酶最适氮源为硫酸铵。这是由于 培养基的碳、氮比不同,对菌体产生的影响。因此, 在发酵过程中应采取酵母膏和硫酸铵结合起来作为氮 源的方式来获得高质量的纤维素分解菌。
图5不同氮源对菌株生长和产酶能力的影响 Fig.5 Effects of the nitrogen sources on growth and enzyme production
3结论
纤维素是地球上最丰富而可再生的生物聚合物。
经初步统计,已发现的具有降解纤维素能力的微生物
有近200种,分布在真菌、细菌和放线菌中[9]。现今
分泌降解纤维素酶微生物的研究主要集中在陆生菌,
且集中在丝状真菌的研究上,对海洋菌的研究较少 [10]。
在很多平板降解圈直接分离法分离CMCase菌 株的方法中,以刚果红法为最好。其它的方法有的受 底物来源的限制,有的灵敏度低需培养较长时间,有 的则因杀死菌体而需用影印移植,这就造成很多不便。 而采用刚果红法则无上述缺点,刚果红对菌体无任何 不良的影响,产生的透明圈清晰,非常容易辨认,特 别是它的高灵敏度,只要菌落长到用肉眼可见,就可 产生清晰的透明圈。刚果红法除可用于识别产纤维素 酶的菌株,还可用于初步判定酶活性高低[11]。
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采用划线分离法筛选出4株具有纤维素酶活性的 菌株,均为革兰氏阴性细菌。其中,YX-3和菌株YX-6 为芽孢杆菌。菌株YX-6所产纤维素酶温度适应性较强,在20~60 °0均有较高的活性。其中,最适酶促反 应温度为40°C;菌株YX-6生长及产酶的最适pH值 为7.5,最佳碳源为澳门威利斯人88038,最佳生长氮源为 酵母膏,最佳产酶氮源为硫酸铵。本研究将为海洋生物酶的开发和利用提供更多的 资源基础。
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