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透明颤菌血红蛋白基因的导入对黄原胶合成的影响

发布日期:2015-04-13 15:35:20
血红蛋白基因
  黄原胶是由野油菜黄单胞杆菌(Xanthomonas campestris)以碳水化合物为主要底物发酵而产生的 酸性胞外杂多糖,为米白色或浅米黄色粉末,具有高 黏度、耐高温、抗盐碱及抗剪切等独特的理化性质, 而且无色、无味、无毒、食用安全、易溶于水,在水溶液中呈多聚阴离子。因此,黄原胶被广泛用于石油 开采、食品医药、陶瓷等轻化工领域[1-2]。野油菜黄 单胞杆菌为革兰氏阴性好氧菌,它在发酵过程中由 于黄原胶的产生而使菌液变得十分黏稠[3],发酵液 溶氧量下降,菌体的生长受到限制,导致产量降低。
  
  透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla Hemo globin,VHb ) 是透明颤菌(Vitreoscilla )在贫氧环境下诱导产生的 原核细胞中的血红蛋白基因,由146个氨基酸组成,相对 分子量15 775[4-5]。透明颤菌血红蛋白通过增加氧 流向细胞色素末端氧化酶的量,来提高细胞内氧浓 度[6],它能够从分子水平上提高菌体对氧气的利用 能力。目前,透明颤菌血红蛋白基因(ugb)已经被成 功克隆到多种微生物体内,并得到了表达[7-10]。
  
  为了利用ugb基因的优良特性对生产菌株进行 遗传改造,本研究旨在将含有Ugb的重组质粒pUC- LV,转入野油菜黄单胞杆菌中,研究ugb基因的导入 对黄原胶生成的影响。
  
  1材料与方法1.1材料1.1.1菌种和质粒野油菜黄单胞杆菌(Xan- thomonas campestris)W12菌株,本实验室保存,无氨 苄抗性;质粒pUC -LV,本实验室构建,含有570 bp 的ugb基因。
  
  1.1.2培养基LB培养基,见参考文献[11]再 生培养基及摇瓶试验培养基,见参考文献[12 ]。 1.1.3原生质体制备用溶液SMM溶液5 mol/L 蔗糖,0.02 mol/L 顺丁烯二酸,0.02mol/LMga2• 6H20, pH 6. 5; 4倍浓度的PAB溶液:牛肉膏1. 5 g/ L,酵母粉1. 5 g/L; SMMP溶液:4倍浓度的PAB溶 液和2倍浓度的SMM溶液等体积混合。高渗溶液:0.5 mol/L 蔗糖。
  
  1.2方法1.2.1质粒的提取和纯化采用文献[11]的方法。
  
  1.2.2 黄单胞杆菌原生质体的制备采用文献 [13]中的方法。
  
  1.2.3黄单胞杆菌原生质体电转化取制备好的 原生质体200 !L加入10 !L质粒,混匀后,将其放 入电击杯中,冰浴5 min。然后,使用LN-101基因 脉冲导入仪进行电击,将电容设为20 pF,电压设为1.8 kV,电转化完成后,将原生质体悬浮液倒入离心 管中,再加入800 !L高渗溶液,28C摇床 150r/min,培养1.5~2h。涂布于完全再生培养基 培养48 h后,将其相对应的影印到含有氨苄西林钠 的LB平板上,于28C培养2 ~3 d,观察转化菌的生 长情况。
  
  1.2.4黄单胞杆菌转化菌株的筛选菌体生长后, 再挑取长势较好的单菌落接到含有相同氨苄浓度的 10 mL的LB液体培养基中,在相应温度下,振荡培 养,再次筛选长势较好的菌体进行随后的试验。
  
  1.2. 5转化菌株的鉴定取100 !L菌液10 000 r/ min,离心2 min,弃上清液,加等体积TE,沸水中煮 10 min以该菌液为模板,PCR扩增[14]。
  
  1.2.6摇瓶发酵及产胶量的测定参照文献[12] 中的方法。
  
  2结果与分析2.1黄单胞杆菌的电转化条件采用20 !F的电容,电压在0.6 ~ 2.5 kV之间的转化条件,对黄单胞杆菌原生质体进行电击转化 表1)。
  
  由表1可见,只有20 !F电容,1.8 kV的转化条件出现了大量的转化菌,其他处理的转化效率很 低。这可能是在原生质体电击转化的过程中,由于 膜被局部击穿,形成一些瞬时的孔洞,这些孔洞的大 小足以让质粒DNA分子进入细胞,从而达到对受体 进行外源DNA转化的目的。而一些更高的电压造 成原生质体大批量的死亡,致使不能在再生培养基 上再生出细胞壁,也无法将外源DNA转入。
  
  表1黄单胞杆菌原生质体电转化条件 Table 1 Condition of electroporation for protoplasm of Xanthomonas序号Serial number电容/!FElectriccapacity电压/kV Voltage时间/ms Time转化效率Transformationefficiency1200.61.274-2200.81.118-3201.01.512-4201.21.503-5201.51.076+6201.81.586+ +7202. 01.366+8202. 21.024-9202.50. 896-注“-”代表转化效率很低,几乎没有转化子;“+”代表转化 效率适中,有一些转化子;“ + +"代表转化效率很高,有大量的转化 子.
  
  2.2 黄单胞杆菌转化菌株的筛选挑选500个转化菌,在10 mL LB液体培养基 (含氨苄西林钠0. 1 mg/mL)中初筛出50个转化菌, 进行摇瓶发酵复筛。结果,筛选出的W1、W2、W3、 W4和W5与初发菌株相比,菌落形态相同(图1)。
  
  试验结果表明,通过原生质体电转化的方法,可 以成功得到转化菌,转化菌具有氨苄抗性。
  
  2.3转化菌株的PCR鉴定PCR扩增结果显示,所获得的转化菌株与含有 透明颤菌血红蛋白基因的质粒pUC-LV的PCR结 果一致,都具有570 bp的基因片段,而初发菌没有 扩增出相应的条带,表明透明颤菌血红蛋白基因 ugb转入了黄单胞杆菌中。PCR电泳图谱如图2。
  
  2.4转化菌株黄原胶产量的测定结果以W12为对照,分别对转化菌株W1、W2、W3、 W4和W5进行摇瓶发酵试验,比较初发菌株和转化 菌株的增长量。增长量=(转化菌的干重-W12的 干重)/ W12的干重,结果见表2。
  
  由表2可以看到,转化菌摇瓶发酵产生的黄原 胶均比初发菌的高,最高可达到2. 96 g/100g,增加 了近22. 19%,平均增加了 15. 91%,表明透明颤菌 血红蛋白基因Ugb的导入有利于黄原胶的合成,增 加了转化菌的黄原胶产量。
  
  表2转化菌株的黄原胶产量Table 2 Yield of Xanthan gum of Xanthomonas transforments菌株Strains黄原胶产量(g*100g-1)
  
  Yield of xanthan gum增加量/%Increasing amountW122.42-W12. 8115.97W22. 8316.83W32. 7915.18W42. 9622.19W52. 659. 403结论与讨论黄单胞杆菌多糖的生物合成是由多个酶参与代 谢调节的结果,产胶基因是1个约16 kb彼此毗邻 的基因簇,以此为受体菌构建工程菌提高产量比较 困难[15]。一些学者在对该菌进行遗传改造时均采 用三亲本接合法[15-17]。本研究通过原生质体电转 化的方法,将含有ugb基因的质粒pUC-LV转入到 黄单胞杆菌中,通过PCR扩增,检测到转化菌中含 有外源基因Ugb,表明本研究利用原生质体电转化 法得到了黄单胞杆菌的转化菌,这种方法与三亲本 接合法相比简单易行,同时也为外源基因导入黄单 胞杆菌提供一个便捷、有效的方法。
  
  溶氧在黄原胶发酵中有着非常重要的作用,通 常发酵液中的溶氧浓度影响到黄单胞杆菌的生长速 率、黄原胶的生成率以及黄原胶的质量,因此,加强 菌体的氧代谢水平对黄原胶的生成具有促进作用。 郭宏秋等[18]报道ugb基因转入受体菌后,可以提高 转化菌体的自身摄氧能力。本研究将ugb基因转入 黄单胞杆菌中,摇瓶试验表明,转化菌的黄原胶产量 比初发菌平均提高了 15. 91%,说明ugb基因的导入 有利于黄原胶的合成。
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