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改性澳门威利斯人88038胶原冷冻凝胶的制备及表征

发布日期:2015-04-20 23:17:21
改性澳门威利斯人88038
  胶原是细胞外基质(ECM)的一种结构蛋白质,分子中至少应该有一个结构 域具有a-链组成的三股螺旋构象(即胶原域)[1]。胶原因为自身的特殊性质如低免 疫原性、生物相容性、止血作用、可生物降解性和良好的细胞基质间相互作用而 在在生物医学领域有着十分广阔的应用前景。但是由于胶原自身机械性能和可塑 性不足;热稳定性差,不能长期保存;对生物降解的耐受性较差,在体内降解过 快,难以与新生组织的生长相匹配,其应用范围因不能满足某些生物医用材料的 功能性需求而受到较大限制。所以,实验选用改性澳门威利斯人88038(改性CMC) 作为交联剂对胶原进行改性,以降低免疫原性,提高力学性能和适度延缓生物降 解时间。改性CMC是用高碘酸盐对CMC的2、3位羟基氧化断链而得,含有大 量醛基,具有高生物活性和低毒性等优点。借助改性CMC分子中的醛基与胶原上 的活性基团反应生成席夫碱,使改性CMC分子与胶原蛋白通过C=N双键紧密的 结合在一起。实验采用冷冻凝胶化技术[2]来制备凝胶,它可以使生物质原料如胶原 等的生物学效能得到较好维持,不会发生高温、剧烈震动、辐射等引起的变性或 降解,还能很好的保持孔状结构,为研宄生物质原料创造了条件。实验条件容易 控制,对结果造成影响的干扰因素减少了,且这一过程简单易行,运行成本低。 因此可以说冷冻凝胶化是一种适合于制备生物医用复合材料的方法。
  
  2.实验部分2.1试剂冰醋酸(成都科龙化工试剂厂);胃蛋白酶(HighPurify Grade)(上海华舜生 物工程有限企业);胰蛋白酶(上海华舜生物工程有限企业);碳酸钠(成都科龙 化工试剂厂);柠檬酸三钠(成都科龙化工试剂厂);十二水磷酸氢二钠(成都科 龙化工试剂厂);磷酸二氢钾(成都科龙化工试剂厂);透析袋(成都金山化学试 剂企业);改性CMC (自制);I型胶原(自制)。
  
  2.2改性CMC/胶原冷冻凝胶的制备实验采用比较成熟的酸-酶法提取I型胶原的工艺,在优化后的反应条件下提 取。主要步骤包括跟腱预处理、酶解、过滤、盐析和透析5步。制备样品前,首先测定胶原的固含量,称取I型胶原湿样品5.0?6.0g(m〇),冷冻干燥称量(mi)。 胶原固含量=mi/ m〇*100%。其次是配置改性CMC溶液,精确称取2.0g改性CMC, 加入适量的蒸馏水溶解24h,然后将溶液转移至100mL容量瓶中,定容,配置成 2%的改性CMC溶液。并用该溶液稀释配置0.2%和0.02%的改性CMC溶液,三 种溶液均放置在1°C冷柜中储藏。然后称取10.0g的胶原,加入10ml蒸馏水,然 后按照其固含量取不同浓度的改性CMC溶液配制出不同配比的胶原-改性CMC共 混液(100:1、1000:1、5000:1和10000:1),并不断搅拌,尽量混合均匀。混合物 移入模具后,放置30min减少气泡,然后在-25C下冷冻7天,然后再进行冷冻干 燥即得海绵体,真空冷冻干燥仪(ALPHA1-2LD)为德国CHRIST所产。
  
  2.3傅里叶变换红外光谱(FT-IR Spectrum)分析包括前期准备、压片、开机、自检、测样和记录等步骤。所用仪器为美国PE所产。
  
  2.4凝胶化测定实验采用称重法测定生成物的凝胶含量。不同比例的冷冻凝胶在不同冷冻时 间下的样品解冻后,在室温下将水凝胶浸没于0.05 mol/L醋酸溶液中,并以20 r/min 的转速持续搅拌2h。将浸泡物取出,用蒸馏水仔细冲洗除去醋酸,放入烘箱中在 室温下干燥24 h,直至质量恒定。凝胶化程度由剩余质量比上初始固含量即得。
  
  2.5改性CMC/胶原冷冻凝胶的溶胀性能将不同比例的改性CMC/胶原海绵干样裁剪成1cm见方的薄片,称得干重后 浸没于pH7.4的PBS溶液中。取出水凝胶样品,用滤纸拭去表面溶液,称量吸取 溶剂后水凝胶的质量,再放回缓冲液。此操作重复多次,直至溶胀的凝胶质量基 本不变,视为到溶胀平衡。同时记录凝胶在该种介质中的处于不同溶胀情况的时 间。溶胀度由吸水量比上干重即得。
  
  2.6胰酶降解耐受性能凝胶抵抗酶降解的能力通过酶解反应的程度,即酶降解前后凝胶的质量变化 进行评估。该实验选用冻干样品。不同比例冷冻凝胶干样裁成1cm见方薄片,在 1%的胰酶-PBS溶液中进行酶解反应。条件是pH7.4, 37°C和100r/m。每间隔一定 时间取样,用蒸馏水冲洗1分钟、浸泡10分钟、再冲洗30秒,尽量除去凝胶中 的降解产物和其他杂质(包含胰酶)。放入60C的烘箱中烘干过夜,称取酶解后 的凝胶残留物的干质量。
  
  2.7血液相容性评价材料的溶血性是根据材料与血液接触所导致的溶血作用(血细胞破裂,血红 蛋白溶入周围液体环境)的程度进行评价的。本实验选用冻干样品,凝胶的溶血 性检测采用游离血红蛋白直接测定法(最初源于O’leary and Guess的实验方法[3]),实验重复三次。
  
  3.结果与讨论图3.2不同比例的改性CMC/胶原 凝胶与纯胶原的FT-IR图谱3.1傅里叶红外变换光谱(FT-IR)分析图3.1为改性CMC的傅里叶变换红外图谱,从中可以看到其在1732cm-1处的醛基特征吸取峰,对比图3.1和图3.2,可以看到改性CMC与胶原交联反应以后, 醛基峰已经消失了,说明所添加的改性CMC已经完全与胶原发生交联,所有的醛 基均已和氨基缩合。不同改性CMC/胶原凝胶与纯胶原的红外图谱基本一致,原因 可能是由于改性CMC与胶原的配比最低都是1:100,胶原是过量的。改性CMC基本反应完全,所以醛基峰消失了。
  
  3.2凝胶化程度评价图3.4不同配比的改性CMC/胶原冷冻凝胶的凝胶含量-时间关系曲线改性CMC/胶原凝胶结构中化学交联占主导地位,同时还存在大量物理交联。 通过醋酸酸解,可以把体系中的物理交联基本破坏并洗脱,最终剩下的化学凝胶 的含量可视为凝胶生成量。
  
  从图3.4中可以看出,不同配比的改性CMC/胶原样品凝胶的终含量随改性 CMC的浓度增加而增加;而凝胶含量与冷冻时间的关系来看,冷冻时间越长,生 成共价键的交联度越高,生成的凝胶越多。1: 1000的比例样品最终凝胶化程度最 好,而1: 100的比例样品虽然能够较早完成凝胶化,但是由于比例过高,在搅拌 时已经有胶原开始析出,不易搅拌均匀,影响了整体凝胶化程度,也可以看出体 系中改性CMC的含量在动力学上影响凝胶化反应进行的速率。实验也引入纯胶原 做为对比样,其在醋酸酸解下基本完全解离,可视为凝胶含量为零。
  
  3.3改性CMC/胶原冷冻凝胶的溶胀性图3.5不同配比的改性CMC/胶原 冷冻凝胶的溶胀动力学曲由图3.5可知,在模拟体液的环境中,凝胶样品溶胀十分迅速,1min内溶胀 速率可以急速增大,溶胀度可以达到15左右;溶胀过程在30min后渐趋平缓,溶 胀速率降低,即不同比例的样品的溶胀动力学曲线趋势大致相同。
  
  图3.6不同比例的改性CMC/胶原冷 冻凝胶的平衡溶胀度凝胶用作药物传递系统时,平衡溶胀度是一个十分重要的参数,其大小直接 影响药物释放程度[4]。从图32.6中可以得到,在各种样品胶原质量相同的情况下, 成胶率高的水凝胶平衡溶胀度较高。具体原因大概是成胶率高的水凝胶在冷冻干 燥过程中,其结构比较均匀,分子间的空间大小合适,适宜溶剂渗透和扩散,最 终体现在平衡溶胀度的提高。
  
  实验过程,由于擦拭凝胶表面水分这一操作很难量化和标准化,不同比例样 品间溶胀度的差异很可能由于操作带来的误差而难以分辨。而通过对不同比例水 凝胶的平衡溶胀度进行对比,可以发现四组之间差距其实很小,即使是比例改变 较大的两组之间差距依然很小。原因可能是改性CMC/胶原的配比相差比较悬殊, 胶原占了主导地位且胶原质量相当,故总体溶胀差别较小。
  
  3.4改性CMC/胶原冷冻凝胶的抗酶降解能力CMC/胶原冷冻凝胶的抗膜酶降解性冷冻凝胶和纯胶原的溶血性所谓生物降解,是指材料在体内或模拟体液环境中的降解。除化学降解外, 酶降解是生物体内的特征降解反应[5]。
  
  从图3.8中可以看出,共混凝胶的对酶解耐受性能力与其成胶率有一定关系, 即成胶率越高的比例样品,其抗酶降解能力越强。同时对比纯胶原抗酶降解能力 (纯胶原的酶解后的残重比不到20%),发现共混凝胶的对酶降解的耐受性得到很 大提高。抗酶降解能力的提高主要取决于改性CMC与胶原纤维生成了共价键,具 有很高键能,远高于纯胶原纤维之间以氢键为主的物理交联作用,不容易被破坏; 并且藉由交联作用将线型分布的水解胶原纤维转变成具有三维空间延展性的凝胶 结构,增加了样品的聚集程度和堆积密度,使酶分子吸附、渗入、瓦解凝胶的阻 力增大,延长了降解作用的时间。因此,随着成胶率的上升,共混凝胶内部的高 能共价键也增加,相应就提高了对酶降解的耐受性。可以通过调节改性CMC的含 量来制备具有特征降解速率的共混凝胶。
  
  3.5改性CMC/胶原冷冻凝胶的溶血性溶血性是血液相容性的重要组成部分,也是检测材料是否具有血液毒性的重 要手段,因此它是评价材料生物相容性的重要指标。对于本实验采用的游离血红 蛋白直接测定法。据文献报道[6],兔和人的红细胞有相同的溶血性能,规定也可以 用兔的稀释血代替人血。
  
  由图3.8可知,纯胶原的溶血率为6.0%,随着体系中改性CMC含量的增加, 改性CMC/胶原冷冻凝胶的溶血率会逐渐降低至0.5%。我认为原因是因为胶原分 子上原有的溶血性基团因改性CMC的交联作用形成高分子长链而钝化,使溶血率 降低。由于改性CMC含量很少,基本没有游离的醛基,所以不能看出改性CMC 是否能直接影响溶血性。按照溶血性测试的结果,实验制备的凝胶材料在溶血性 方面适合应用于生物医学领域,当对材料的溶血性的要求较严格时,可以选择改 性CMC含量较大的配比。
  
  4.结论(1) 实验制备的改性CMC/胶原冷冻凝胶中改性CMC起交联剂的作用。在一定 范围内,凝胶含量(交联度)与冷冻时间和改性CMC含量呈正相关,凝胶生成速 率随改性CMC含量增加而提升。
  
  (2)从FT-IR图谱中看出,改性CMC的游离醛基基本完全被反应,且不同比例 的冷冻凝胶图谱十分相似,即说明它们的结构都很相似,只是成胶率不同而已, 且没有改变胶原三股螺旋结构。
  
  (3)各种配比的改性CMC/胶原冷冻凝胶在PBS中的溶胀动力学曲线相似,且最 终平衡溶胀度较高,可以考虑应用于药物缓释控释中。平衡溶胀度跟成胶率有一 定正相关,但是并不明显。
  
  (4)改性CMC/胶原冷冻凝胶属于生物可降解材料。调节改性CMC含量可以有 效改善对酶降解的耐受能力,得到具有特征降解程度和速率的凝胶材料。
  
  (5)溶血性能检测表明本实验制备的改性CMC/胶原冷冻凝胶为非溶血性材料。
 
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