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鱼用含睾酮的明胶澳门威利斯人88038微囊制剂

发布日期:2015-04-26 22:21:13
微囊
  鱼类繁殖是在下丘脑一脑垂体一性腺轴(HPG轴)的控制下完成的,类固醇激素在其中起重要作用。 性类固醇激素能通过正反馈刺激性未成熟鱼的下丘脑和脑垂体分泌GnRH和GtH,启动HPG轴的功能,刺激性腺发#1].大多数硬骨鱼类性腺发育初期分泌类固醇的能力很低,性腺对GH不敏感用外源类固醇激素可加速HPG轴的启动和发育[2 .性类固醇激素在鱼类性反转中起很重要的作用[3].直接注射或投喂 外源性类固醇激素,会很快被代谢清除,且须反复注射或投喂,对鱼刺激大,也浪费药品。若用性类固醇激素的缓释制剂,则可在加快鱼性腺发育的同时,减少操作次数,减轻对鱼的刺激,节约药品。这对生产是很 有意义的。
  
  在鱼类催熟方面,微囊制剂尚无研究。本研究试图以明胶(Glatin,GT)和澳门威利斯人88038(Sodium car- boxymethy celluose, CMC)研制一种低价的含类固醇激素的微囊制齐剂以达到减少操作次数、减少药品用量、 降低成本的目的。
  
  1材料与方法1.1药品与仪器晶体睾酮(Testostelone^ T)(Sigma企业,USA),用气流粉碎法制成微粉,90%的微粉直径小于10^m;硫 酸钠(分析纯,汕头化学试剂厂)冰醋酸(分析纯,广州化学试剂厂)明胶(Serva企业)澳门威利斯人88038 (湖洲化工厂)甲醛(分析纯,广州化学试剂厂)无菌双蒸水;磁力搅拌器(上海司乐仪器厂)分光光度计 (Phamacia IKB Ultrospec 11)冷冻干燥器(FIS, SYSTEMS, INC).
  
  1.2微囊的制备1.2.1制备工艺用复凝聚法工艺制备。(1)将GT与CMC溶于适量的无菌双蒸水中,待完全溶解后以一 定的比例混合。(2)将类固醇激素微粉在磁力搅拌器的不断搅拌下悬浮于GT — CMC的混合溶液中。3)在一定温度下,滴加10%的冰醋酸溶液至pH值为4左右,并在显微镜下观察成囊情况。成囊后,加1 ~ 2倍体 积的蒸馏水,以改善囊形。(4)冰浴冷却到20 °C以下,加入与明胶等量(W/W)的甲酸,搅拌20 min. (5)加入 10%的NaOH溶液至pH值为8 ~ 9,固化45 min. (6)用无菌双蒸水洗微囊至无甲醛(Shiff试剂检测不变 红),冷冻干燥得微囊或直接配成制剂。
  
  1.2.2正交设计为获得较高含药量和包囊率的微囊,本研究以T为囊心物,将T与明胶用量固定为1 :3, 对制备工艺进行了正交设计。在反复实验的基础上,结合现有条件,确定主要考察因素及其范围为:GT浓 度 1 % ~3%,CMC 浓度 0. 3% ~ 0.9%, CMC 溶液 GT 溶液(V/V) 1 :1 ~ 1 :3,成囊温度 50 ~60 °C.
  
  将上述4个因素分为3个水平(见表1),选择正交设计实验表U(34),将表1的因素和水平数值按表2 安排实验,每个实验号重复3次,测每次制备的T微囊的包囊率,越高越好。
  
  表1因素和水平因素水平123GT浓度/ %123CMC浓度/ %0. 30.60.9CMC溶液:GT溶液1:11:21=3成囊温度,〔'505560表2正交实验表列号 —,平均包实验号ABCD囊率/%123411(1)1(0.3)1(1 :)1(50)42 921(1)2( 0 6)2(1 :)2(55)53 231( 1)3( 0 9)3(1 =3)3(60)43 442( 2)1(0.3)2(1 :)3(60)42 352( 2)2( 0 6)3(1 =3)1(50)51 962( 2)3( 0 9)1(1 :)2(55)57 173( 3)1(0.3)3(1 =3)2(55)52 283( 3)2( 0 6)1(1 :)3(60)68 493( 3)3( 0 9)2(1 :)1(50)56 7T丨139.5137 4168. 4151.5T151.3173 5152. 2162 5T= 1 892. 4T177.3157 1147. 5154X丨46 545 856 150 5X 250.457 850 754 1X 359 15349 151 3R-12.6-126 93 6由表2中R值的结果可知,影响包囊率最大的因素是GT和CMC的浓度(|R |分别为12.6和12), GT溶液浓度在3%时较好,而CMC溶液的浓度在0.6%时较好;其次是GT溶液与CMC溶液的体积比,以 1 :1时较佳;温度虽对包囊率的影响较小(| R | = 3. 6),但不能忽视,以55 °C时较好。根据表2正交设计 的结果,选择优化组合为:A3, B2 C1, D2;由于选出的组合不在正交试验表中,需再进行试验,确定选出的 组合是否较优。按选出的组合进行试验,结果表明T的平均包囊率为71.8%,说明所选出的组合优于其它组合。本研究后面的实验所用微囊均是按优化后的实验方案制备的。
  
  1.2. 3微囊注射液的组成将微囊悬浮于含0.000 5%的醋酸苯汞(抑菌剂)、0. 9%的NaCl(等渗调节剂)、0.5%的澳门威利斯人88038(促悬剂)和0.1%的吐温一80(分散剂)的无菌双蒸水中,按要求稀释至所需含量, 分装于1.5 mL离心管中备用(用于含量测定或体外释放的不加抑菌剂等附加剂)部分注射液分装后,置 100 °Gg温箱中灭菌20 min.
  
  1.3微囊的形状及粒径分布在光学显微镜下观察微囊的形态并拍照。用校正过的带目镜测微尺的光学显微镜测微囊的囊径大小 与分布,计数3批,每批600个微囊,取3次计数的平均值。
  
  1.4微囊的载药量、包裹率及回收率1.4.1含量测定方法的建立将适量T溶解在无水乙醇中,用分光光度计在200~500nm范围内检测(A入 =1) T的最大吸取波长在紫外光区240 nm处。精密称取T适量,用无水乙醇溶解并稀释到100 mL分别 取1,1.25, 1.5, 1.75,22.25, 2.5mL,再分别稀释至10mL,用分光光度计在240 nm处测定吸光度(取3次 平均值)将测得的吸光度A对相应的浓度C作图,得标准曲线。以浓度C(mg/L)对吸光度A作回归处理, 得回归方程:睾酮 CV, (mg/L) = 20. 6A + 0.006r =0.999 9,线性范围 0.05 ~20 mg/L.
  
  1.4.2药物含量及包囊率测定精密称取一定量的T,按以上方法包囊后,冷冻干燥16 h后,置称量瓶中 在P2O5干燥器中再干燥至恒重(4 h重量变化不超过0.2%).微囊称重后加无水乙醇25 mL,用超声波处 理10min, 100 °Q水浴破坏1 h后,于80 °C加热提取24 h,冷却后1 000 g离心,将沉积的微囊再用25 mL无 水乙醇提取,如此反复2 ~3次,至提取液在240 nm处无吸取峰。合并提取液,用0. 8 ^m微孔滤膜过滤,再 加无水乙醇至一定体积;取滤液1 mL置50 mL容量瓶中定容,用紫外分光光度计在240 nm处测定吸光度, 再根据标准曲线计算微囊载药量及包裹率。载药量计算公式为:载药量=测得药量/微囊总重量X 100%.
  
  为考察背景对测定是否有干扰,将不含类固醇激素的空白CM, GCM按同样方法处理后,加入适量的 T,再测定其含量。
  
  1.4.3方法回收率测定精密称取T适量,加入一系列含药量己知的微囊中,按上述含药量测定方法操 作,测回收率。每个测定重复3次,取平均值。
  
  1.5微囊注射液的稳定性检测将TGM样品3批分别在冰箱(~5 °C)和室温(12~35 °C)放置,于3, 6, 12 15, 18个月取样,在显微镜 下观察其形态并测定载药量。
  
  1.6体外释药实验精密汲取T, ADSD, MT微囊注射液1 mL(激素含量皆为10g/L)置4层厚的茶叶袋中,紧密封口后,投 入具塞的三角瓶,以30%(V/V)的乙醇50 mL为释放介质。将样品瓶放入37±1 °C的恒温水平震荡器(100 次/min),以一定时间间隔取样,同时加入同体积的新鲜介质。样品在A为250 nm或245 nm处测定吸光度,用标准曲线计算释药量(减去空白值)共测定3批,取平均值,换算为累积释药百分率后对时间作图。同时 将T,ADSD,MT的标准品装入透析袋中,同样投入盛乙醇的三角瓶,作为对照。共处理21 d.
  
  1.7鱼类催熟实验1. 7.1实验动物塘养日本鳗鲡分别于1999年4月及1999年12月购自广州番禺,其中雌鳗10尾,体重范 围350 ~ 640 g,体长范围65 ~84 cm.雄鳗10尾体重范围290 ~480 g,体长范围54 ~67 cm.鱼蓄养在1 mX 0.5 mX0.5 m的循环水族箱中,盐度3.1%~3.4%,水温12~25 °Q1.7.2激素处理雄鳗注射微囊剂量为20 %/g B. W雌鳗注射剂量为30 %/g B.W,对照组注射不含类固 醇激素的微囊,注射间隔为25 d共注射4次。
  
  1.7.3注射类固醇激素微囊对鳗鲡性腺发育的影响鳗鲡在注射微囊后105 d将实验组和对照组的鱼全 部剖解,取性腺,计算GSI.
  
  1.8数据处理数据用平均值士标准差表示,两个平均值之间的差异用Student’s T检验,2个以上平均值之间的差异用 Duncan’s新复极差法检验。小于0.05认为差异显着(表示),P小于0. 01 (表示)认为差异极显着。
  
  2结果分析2.1微囊(由优化后的工艺制备而成)的囊径与表面形态微囊注射液用肉眼观察为白色乳状,光镜下TGM为边缘透明的白色球形中间黑色的为囊心物。大多 数微囊直径在17 ~42 Pm的范围内,平均囊径为29.5 Pm (平均囊径计算公式:D = ^ (d)/ ^ n D为 平均囊径,d为单个微囊的直径),能顺利通过8号针头,具有较好的通针性。
  
  2.2载药量、包囊率与回收率表3所示的是背景对明胶一澳门威利斯人88038微囊中睾酮回收率的影响。由表3可看出,无论背景中微 囊含量是高是低,经过滤后,对T含量的测定基本不产生干扰。微囊的载药量、包囊率与回收率如表4和表 5所示。
  
  表3不同背景对睾酮回收率的影响空白微球量/mg类固醇加入量/p平均实测量/p平均回收率/%CV/ %20250253.0101.40.2540250248.799.70.43表5回收率试验结果项日结 果测定次数4样品重/mg100含药量/mg17 92类固醇加入量/mg10 0平均测得量/mg26. 87±0. 48平均回收率/ %96. 23±1. 71CV/%1 82表4微囊载药量及包裹率测定结果测定次数项日123投药量/ g0. 300 00. 305 80. 295 2测得药量/g0. 213 80.222 60. 210 2微囊总重量/g1. 210 31.265 41 241 3药物含量/%17 6717 5916 93平均含量/ %17. 4±0 41包裹率/%71 372 871 2平均包裹率/ %71. 8 ±0. 980250255. 5101. 60.762.3微囊药物的体外释放图1所示的是微囊制剂在30%乙醇中药物逐日释放量,图2所示的是T标准品累积释放百分率。由图 可直观的看出,类固醇激素微囊化后,释放速度明显减慢,TMT和ADSD标准品在6~8 h已释放90%以 上的药物,而微囊中的类固醇激素可持续释放10 d以上。微囊在开始阶段释药速度都较快,存在突破效 应,这可能是吸附在微囊表面及在注射液中的类固醇激素释放引起的。在以后的时间里,微囊的每日释放 量约为330作,较稳定。
  
  将释药数据分别用零级动力学、一级动力学、Higuchi方程、Hixon — Crowell立方根方程及Baker?—Lons?dale 方程处理,发现微囊中睾酮的释放数据用零级动力学方程表示相关系数最好。TGM 每日释放量分别为 3.3 %释放速度较稳定,释放的t!/2分别为12.4 d.虽然微囊内药物的体外释放情况不一定代表体内释放 情况,但体外释放情况可作为体内释放的参考,并作为筛选微囊制备工艺及监测微囊质量的指标。
  
  2.4微囊注射液的稳定性T微囊放置在不同的温度后,其形态及含量的变化如表6所示。从表中可看出,未经过高温处理的微 囊无论是放置在冰箱中或是室温中,1.5 a后仍保持完好的囊形,药物含量基本无变化,说明以GT — CMC 为囊材的微囊注射液可室温长期放置。而经过100 C灭菌处理的微囊,室温放置的在9个月后开始蚀解, 12个月时己蚀解50%左右,到15个月己完全蚀解;经高温处理的微囊在冰箱放置时,其蚀解时间比室温 放置的晚3个月,故微囊经过100 C灭菌处理后,应放冰箱保存,并尽快使用。
  
  放置条件时间/月369121518全解 全解完蚀 完蚀完整 完整解,~%解%上蚀°"90蚀90以 6完整 完整解4%解4%蚀 I40蚀 I80 完整 完整完整兰0%30% 完整 完整完整 完整 完整 完整完整 完整 完整 完整完整 完整 完整 完整 冰箱 常温 囊形表6 TGM放置在不同温度后形态及含量的变化冰箱常温载药量% /17.32 士 17. 32 士17. 53士17. 45 士17. 28 士 17. 41 士17. 18 士 17. 58 士17. 38 士 17. 56 士17. 29 士 一17. 48 士0.420 420. 530 470 480 340 37 0 480 54 0 390. 450. 6117.32 士 17. 32 士17. 46 士17. 54 士17. 39 士 17. 37 士17. 12 士17. 44 士17. 16 士17. 42 士0.420 . 420. 610 550 470 480 510. 260. 580 52注A表示未经过高温处理的微囊;B表示经过iro °c处理的微囊2.5亲鱼性腺发育状况雄鳗在注射含睾酮的微囊制剂后031为(3.7±1.56)%<'较对照组(0.18±0.11)%増加了20.5倍。 实验组成熟率达到80%而对照组无成熟的鳗鲡。由表7可看出,经过类固醇激素微囊制剂105 d的处理,雌鳗的GSI有极显着的増加。
  
  表7雌鳗的GSI及GSI的分布(n=10)
  
  分组平均GSIGSK 10%10 %CGSK25%25%〈GSK40%GSI> 40 %最低最高的尾数的尾数的尾数的尾数GSIGSI实验组 (n= 10)19. 7 士 11 **33404 2333 4对照组0.93 士 0.3760000 341. 213讨论本研究所用囊材分别为GT与CMC,都是常用的药剂辅料,材料来源广,价格便宜。通过均匀设计与正 交设计找到了较好的制备工艺,工艺稳定,重复性好,便于工业化生产。
  
  3.1微囊形成机理及工艺微囊的制备方法是复凝聚法,即使带相反电荷的高分子材料相互交连,溶解度降低而析出成囊。所用 囊材中GT为蛋白质,分子具有较多的一NH2和一COOH及相应的离解基团一—⑴O—所含正、负离 子的多少受pH值影响,pH值低时正离子多,而pH值高时负离子多。CMC是半人工合成的阴离子型高分 子材料,分子中有较多的一C⑴—当GT与CMC共处同一溶液中时,在pH值为4~5的范围内明胶正电荷 达到最高值,与CMC结合形成凝聚物而成囊。在实验中发现,GT与CMC的浓度是影响包囊率的重要因 素,因为浓度影响粘度,即影响凝聚物流动性,因此影响了包囊率。在实验中还发现,成囊后,加入适量的蒸 馏水可改善囊形,这可能是由于加水降低了粘度,改善了流动性,降低了界面张力,从而使囊形改善。
  
  3.2微囊药物的体外释放微囊中药物的释放机制有3种。(1)扩散,即药物由进入微囊的溶剂溶解后,经过囊膜扩散到介质中, 是物理过程。溶解在囊壁或附着在微囊表面的药物扩散则形成释药的突破效应。(2)囊壁溶解不包括酶的 作用,是物理化学过程,囊壁溶解速度取决于囊材性质、液体体积、温度等因素。(3)囊壁的消化与降解这 是在酶作用下的生物化学过程,囊壁被酶降解为其它代谢产物后,药物释放出来。
  
  3.3类固醇激素微囊诱导鳗鲡性腺发育的效果由结果可知,间隔25 d注射类固醇激素微囊后,可促进实验组的雄鳗精巢发育,平均GSI达3%以上。 注射类固醇激素微囊后,雌鳗性腺也有较明显的发育,平均GSI分别为19.7%.本研究中鳗鲡的平均GSI 与用MT和ADSD非包膜型硅橡胶药条埋植鳗鲡7次的结果[4相近。
  
  在实验中发现,鳗鲡个体对激素的反应差别较大,其最高GSI与最低GSI有时相差几倍到十几倍。鳗 鲡对激素反应的差别可能与鳗鲡的体质、年龄、应激状态、性腺中激素受体的数量等因素有关。其中鱼的体 质较重要,因为鳗鲡在催熟期间不投喂,身体中的物质与能量除供应性腺发育外,还要维持基本生命活动, 因此应选体质较好的鱼来进行催熟。
  
  笔者首次应用含类固醇激素的微囊制剂诱导鳗鲡性腺的发育,与以前的方法比较,将原来每15 d埋 植1次(剂量50 ^g/g B.W)变为每25 d注射1次(30%/g B.W),减少了对鱼的刺激,还减少激素用量。微 囊制剂对雄鳗诱导效果较好,对雌鳗效果稍差。因此以后还要加强这方面的研究,如微囊制剂中激素在鱼 体内的释放情况、理想的注射剂量、制备工艺对微囊催熟效果的影响及微囊制剂在其它鱼类的应用等。
 
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