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早籼稻籽粒灌浆过程中淀粉合成酶的变化及温度效应特征

发布日期:2015-05-17 14:13:56
淀粉品质
早籼稻在我国南方由于高温早籼稻米的直链淀粉品质含量普遍偏低或过高[1w3。针对这一问 题,近年来,国内外不少学者从早籼稻的直链淀粉含量的遗传规律、品种特性及环境影响效应角度已做了不少工作[4"6],但是对早籼水稻灌浆结实过程中胚乳物质及酶类变化很少涉 及[1,7],对不同品质类型早籼品种籽粒灌浆过程中有关淀粉合成代谢关键酶活性变化及其温 度效应特征的差异,目前尚不清楚。为此,本文以水稻籽粒灌浆过程中不同类型淀粉的累积 变化特征及有关淀粉合成代谢的关键酶活性分析为基础,并通过人工气候箱控温试验,对不 同品质类型早籼品种籽粒灌浆过程中ADPG焦磷酸化酶、可溶性淀粉合成酶与淀粉分支酶活 性变化及其在不同温度处理下差异特征进行了探讨,旨在揭示不同品质类型早籼间的蒸煮食 味品质差异及温度影响的内在生理基础,为米质的生态、品种改良工作提供理论依据。
 
1材料与方法1.1试验材料试验于1999年在浙江大学教学试验农场进行,选用高直链淀粉早籼品种73 - 07(直链淀 粉含量25.18%)、低直链淀粉含量早籼品种嘉早93,(直链淀粉含量13.21%),3月25日播 种,4月20日移栽,株、行距15 cmx20 cm,田间常规栽培管理,在各品种在生长至齐穗时选 取生长一致的单穗300 "400个,挂牌并标记开花日期基本接近的中、上位势小花,以后每隔 5天取样,液氮中保存,最后统一测定。人工气候箱控温试验使用2台CONVIRON箱,设高温 33<(最高温38</最低温28°C)和适温23<(最高温28</最低18°C)2个温度处理,采用盆 栽土培,在自然温度条件下生长至抽穗后再将稻株移入不同温度处理的人工气候箱中,人工 气候箱内温度的日变化模拟自然气候特征,24h程序自控,相对湿度保持90%左右,光强为 0.5 "2.5万1@,取样方法同大田处理。
 
1.2测定方法1.2.1粗酶液的提取 取样品籽粒25粒,去壳称重,碾磨成粉,加5 mL提取液(含100 mmol^L Tricine-NaOH, pH = 7.5, 8 mmo^^L MgC12, 2 mmo^^L EDTA, 12.5%i( p/v,Glycerol; 1% (w/v)PVP-40,50mmo1/L2-Mercap-toethano1),磨成勾楽,在30000xg尚心10min,然后收集上清液置于冰浴,作为粗酶液备用。
 
1.2.2 ADPG焦磷酸化酶活性的测定取20 yL酶粗提液加入110 !^反应液中(反应液最终浓度是100mmo1/LHepes-NaOH(pH = 7.4)、1.2mmo1/LADPG,3mmo1/LPPi;5mmo1/LMg- C12,4mmo1/LDTT),30°C反应20min后,沸水中终止反应30s,10000xg,10min;取上清液 100 yL 加 5.2 yL 比色液(5.76 mmol/L NADP,0.08 unit P-gucomutase,0.07 unit G6P-dehydroge- 打186, . 30< 反应 10 min 后,测定 340 nmOD 值。
 
1.2.3可溶性淀粉合成酶活性的测定取20 yL酶粗提取液加入36 yL反应液(反应液最终浓度为50 mmol/L Hep es-NaOH(pH = 了,、1.6 mmol/L ADPG、0.7 mg amylopectin、15 mmol/L D订,30<反应20min后,沸水中终止反应30s,冰浴中冷却;加20ML反应液(含50mmol/L Hepes-NaOH(pH = 7.4,、4 mmol/L PEP、200 mmol/L KCl、10 mmol/L MgCl2、1.2 unit Pyruvate Ki?nase, 30<反应 20 min 后,沸水中终止反应, 10000 x g 尚心 10 min。
 
取上清液 60 yL 与 43 yL 反应液(50 mmol/L Hepes-NaOH(pH = 7.4)、10 mmol/L Glucose 20 mM MgCl2、2 mmol/L NADP、1.4 unit Hexokinase、0.35 unit G6P-dehydrogenase),30<反应 10 min 后,测定340 nmOD值的变化。
 
1.2.4淀粉分支酶活性的测定取20 yL粗酶液加20 yL反应液(反应液最终浓度为50mmol/L 1万方数NHH(pH = 7.4,5 mmol/L GlP,1.25 mmol/L AMP,phosphorylase (5.4 unit,30#反应 30 min 后,101 mol/L HC1 终止反应,然后加 100 Dimethylsulfoxide 和 1400.
 
1% 的 12 和 1%KI,测定 540 nmOD 值。
 
1.2.5稻米直、支链淀粉含量的测定参照何照范的双波长法[8],并做适当的改进其中直链淀粉含量测定的主波长用620 nm,参比波长用430 nm,支链淀粉含量测定的主波长用540 nm,参比波长用720 nm。以脱脂精米米粉为样品进行测定。其中对水稻开花后5天的采样, 用手工方法去壳除糙。
 
2结果与分析2.1不同早籼品种籽粒灌浆过程中直、支链淀粉含量的积累趋势由图1、图2可见,不同类型品种,水稻开花后籽粒中直链淀粉与支链淀粉的累积变化趋 势基本相似,大致呈“S”曲线变化。其中直链淀粉的累积变化在水稻开花后5 ~ 15天最为明 显,与此同时,籽粒中支链淀粉含量也在急剧增加,可见,水稻籽粒灌浆过程中支链淀粉的 合成是与直链淀粉的合成同时进行的。高直链淀粉含量品种73 - 07与低直链淀粉含量品种 嘉早935相比,两种类型淀粉的积累趋势均相差不大,但前者的直链淀粉在水稻开花后前15 天的积累速率要明显大于超过后者,说明不同品种的淀粉特征差异主要表现在两种类型淀粉 的相对积累比率上。
 
1品种73-07开花后稻米直、支链淀粉的变化图2 品种嘉早935开花后稻米直、支链淀粉的变化Fig. 1 Change of amylose and amylopectinFig.2 Change of amylose and amylopectin inin rice grain after anthesis ( 73 - 07,rice grain after anthesis ( Jia zao935,水稻籽粒灌浆过程中ADPG焦磷酸化酶、可溶性淀粉合成酶与淀粉分支酶的变化 ADPG焦磷酸化酶、可溶性淀粉合成酶、淀粉分支酶(R-酶)是水稻籽粒淀粉合成代谢的32.2个关键酶,其中ADPG焦磷酸化酶和可溶性淀粉合成酶是水稻籽粒中淀粉生物合成的调节位 点,而淀粉分支酶(R-酶)的作用是通过《-1,6糖甘键形成而影响支链淀粉合成[9。通过对 水稻开花后籽粒中这3个关键酶活性的动态变化分析(图3。图4),结果表明,在水稻灌浆过 程的不同时期,这3个酶的活性表现出明显的差异。在水稻灌浆初期,可溶性淀粉合成酶的 相对活性较高,而ADPG焦磷酸化酶和淀粉分支酶(R-酶)在水稻籽粒灌浆初期的相对活性 则较低,这表明在水稻灌浆的起始阶段,可溶性淀粉合成酶在籽粒淀粉合成代谢中起相对重 要的作用。但是随着水稻开花后天数的推移,可溶性淀粉合成酶的相对活性明显降低]而 ADPG焦磷酸化酶的活性表现与之相反,在水稻籽粒灌浆初期相对活性较低,之后其活性迅速升高,至开花后15天左右时其活性达到高峰值,可见该酶在水稻灌浆中期的作用最为活 跃;淀粉分支酶(#-酶)的活性在水稻开花后15%20天左右达到最高,其活性高峰要明显滞后 于ADPG焦磷酸化酶,这说明在水稻灌浆中、后期,籽粒中支链淀粉的合成代谢仍相当活跃。 而高直链淀粉类型品种73- 07和低直链淀粉类型品种嘉早935相比,上述3个酶在水稻籽粒 灌浆过程中的活性变化趋势差别不明显。
 
2.3 ADPG焦磷酸化酶、可溶性淀粉合成酶 与淀粉分支酶活性对温度的反应温度对稻米直、支链淀粉的含量变化有 着较大的影响,这已为前人的诸多研究结果 所阐明。为了对温度影响稻米直链淀粉含量 的内在生理特征有一更深入的认识,本研究 分别测定了 ADPG焦磷酸化酶、可溶性淀粉 合成酶与淀粉分支酶在20°C,25°C,30L, 35°C,40L五个不同温度下的活性变化特征 (见图5、图6),结果发现,ADPG焦磷酸化 酶和可溶性淀粉合成酶的活性在不同温度下 虽然有所变化,但差异不明显,以25 % 35L 温度范围的酶活性稍高,这说明上述两个酶 的活性表现对温度影响反应相对较为迟钝, 与之相反,淀粉分支酶(Q-酶)在不同温度下的活性差异较大,其活性表现对温度变化的反应 则较为敏感,且淀粉分支酶的活性随温度变化大致呈双峰分布,可见淀粉分支酶(Q-酶)的活 性变化与温度间的关系较为复杂。上述现象可以说明,在水稻籽粒淀粉合成代谢的3个关键酶中,淀粉分支酶(A-酶)可能是温度对稻 米直、支链淀粉含量变化产生调节作用的 一个重要位点。高直链淀粉类型品种73- 07与低直链淀粉品种嘉早935相比,其淀 粉分支酶(A-酶)活性随温度的变化趋势基 本相似,即当温度为201左右时,酶的活 性处在较高的水平,随着温度的升高,其 活性呈明显下降趋势,至301左右时酶的 活件最低,之后随着温度的讲一步h升高到351左右时,酶的活性又有一峰值出 现。但是高直链淀粉类型品种73 - 07与低 直链淀粉含量品种嘉早935两者淀粉分支 酶(Q-酶)活性,在不同温度下的表现差别 在于,前者在201左右时的峰值相对高于 后者,而在351时恰好相反。由此可见,淀粉分支酶(Q-酶)在不同温度下的活性表现也可能存在着一定的品种类型特征。
 
表1人工气候箱不同温度处理下籽粒中淀粉分支酶活性的变化2.4Table 1 The changes of starch branching enzyme under the籽粒中淀粉分支酶活性different temperature treatment controlled in chamber白勺影口向开花后时间 Days after anthesis73.-07嘉早 935 Jiazao935高温(331, HighT. (331,适温(231, ProperT. (231,高温(331, High T.(331,适温(231, ProperT. (231,54.13.45.42.715162.4171.3147.5116.22554.351.445 . 758.9利用人工气候箱设 高温331 (最高温 381/最低温281,和 适温231 (最高温281/最低181)2个温度典型处理,通过对两个品种在不同温度下籽粒灌浆过程中淀粉分支酶的活性变化分析(见表1,结果发现,不同 温度处理下淀粉分支酶的活性差异以水稻开花后15天左右最明显,低直链淀粉品种嘉早935 在日均温度331下的淀粉分支酶活性要高于日均温度231处理的活性,而对高直链淀粉类 型品种73 -07而言,两者差异不明显。说明水稻灌浆结实中期的较高温度环境似乎更有利于 低直链淀粉类型品种的淀粉分支酶活性发挥。
 
3讨论水稻灌浆结实期间的温度对稻米的直、支链淀粉的含量及比率有着显着的影响[10。 Masaka Asaoko等人认为稻米直链淀粉含量与结实期温度呈负相关[11,但Gomez等人认为呈正 相关[12],而更多的学者则认为两者间关系与品种本身的遗传特性有关[13~15。总之关于二者 间的关系目前尚无定论。在以往大量研究中,多是通过研究成熟期间的表现型变化来探索其 影响程度的h-16。而对胚乳整个发育过程中复杂的生理生化变化及优质的生理特征研究则 较鲜见[7, 17。本研究结果发现,水稻灌浆过程中籽粒中淀粉合成代谢有关关键酶如可溶性淀 粉合成酶、ADPG焦磷酸化酶和淀粉分支酶的活性变化及其温度影响效应,不同类型品种之间既存在着共同的规律,也有其固有遗传特征的差异。淀粉分支酶(!-酶)活性表现一般在水 稻开花后20天左右最高,滞后于可溶性淀粉合成酶、ADPG焦磷酸化酶,而淀粉分支酶的活 性变化与温度间的复杂关系,很可能是造成前人关于稻米直链淀粉含量与温度间关系的纷乱 研究结论所在。
 
P. L. Keeling (1993 )[20)曾对小麦发育籽粒中ADPG焦磷酸化酶、UDPG焦磷酸化酶 (UDPGPPaSe)、可溶性淀粉合成酶等酶的活性与温度间的关系作过分析,结果发现,该酶的最 适温度为20~25°C,温度升高,酶活性下降(称“knock down”现象),而温度升高对ADPG焦磷 酸化酶、UDPG焦磷酸化酶等的活性影响不大,JenneA(1993,[21]也发现,35:处理的小麦谷粒 30 min,其可溶性淀粉合成酶的活性下降50C。本研究通过对水稻灌浆籽粒中ADPG焦磷酸 化酶、可溶性淀粉合成酶与淀粉分支酶活性在20C,25C,30C,35C,40C五个不同温度下 的测定分析,发现ADPG焦磷酸化酶的活性在不同温度下表现较为稳定,这与前人在小麦上 的研究结论相一致,但是在不同温度下可溶性淀粉合成酶的活性变化,虽然在25C ~30:左 右时的活性稍高,但其活性变化幅度远不及淀粉分支酶明显,而不同温度下淀粉分支酶的活 性差异较大,可能是温度对水稻籽粒淀粉合成代谢产生影响的调节位点。这种现象是小麦与 水稻两个不同作物间的差异,还是由于前人未在同一实验中对两个酶的温度效应特征缺乏比 较所致,尚不清楚。值得进一步研究。
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