联系大家 / Contact

  • 澳门威利斯人88038
  • 联系人:王伟
  • 电 话:0533-8299008 13280657534
  • 手 机:13280657534
  • 传 真:请填写您的传真
  • 邮 箱:sddachina@163.com
  • 网 址:http://www.sdcmcchina.com/
  • 地 址:山东省淄博市周村区开发区工业园16号

降解纤维素真菌的分离筛选及其环境适应性初探

发布日期:2015-05-20 17:37:53
分离筛选
能够降解纤维素的微生物很多,可是目前的分离筛选研究却大多数集中在有限的几个菌株上,如康宁木霉,里氏 木霉等,然而这些菌株仍然存在着产酶成本高,酶活性 不稳定,作用pH范围狭窄等问题。要想更好的应用微 生物的降解功能,需要在菌种筛选和反应条件方面更 深入研究。
 
1材料与方法 1.1试验时间、地点研究试验于2007年在西北农林科技大学生命科 学学院微生物研究室进行?
 
1.2试验材料1.2.1试验样品腐烂秸杆取自杨凌张家港村田间;牛 粪取自张家港村个体养殖户;标准木霉菌种来源于西 北农林科技大学生命学院微生物实验室。
 
1.2.2 培养基富集培养基 P>[g/L]:Na2HPO44.0g, KHm 2.0g,NaCl 0.5g,NH4NO3 0.5g,MgSO4 .71120 O.Olg (NH4) 2S04 0.4g, KNOj 0.4g, CMC-Na 30.0g.
 
纯化培养基査氏)[g/L]:纤维素(滤纸)30g, NaN03 2g,FeS04 O.lg’KjHPO* 0.5g,KCl 0.5g,MgSCV 7H2O0.5g,蔗糖 30g,琼脂 15g。
 
初筛培养基[51(琼脂糖平板)[g/L]:磷酸氢二钾一 柠檬酸缓冲液500ml, CMC-Na 0.5g,琼脂7.5g。
 
复筛培养基w [g/L]: CNH4>2S04 lg,0.44g/L ZnS04 5ml,K2HP04 0.1g,0.1g/L MnS04 5ml,FeS〇4 2.5mg> KH2P04 0.4g,CaCl210mg,酵母育 0.5g,MgS04 0.45g, 蛋白胨lg,0.01g/L维生素B, 10ml稻草粉1.5g。
 
1.2.3试剂3,5—二硝基水杨酸(DNS)溶液,磷酸氢二钾一柠 檬酸缓冲液,新华1号滤纸。
 
1.3试验方法1.3.1窗集培养先将采集回来的样品用三角瓶溶解。 将三角瓶置于恒温摇床培养箱30*0180r/min下培养 24h。分别经过连续3次富集培养,以使纤维素分解菌 达到一定浓度,衡量标准即培养基黏度明显减低。
 
1.3.2纯化经过富集培养,取菌液在无菌操作下进行 涂布分离,在SO。下温箱培养5d。由于菌液浓度过高, 菌较为密集且小,并将划线后的培养皿置于3010培养 箱进行纯化培养。经过几天培养后,再将纯化后的单菌 落进行斜面培养。
 
1.3.3初筛(琼脂糖透明圈法)在无菌操作下,将纯化 斜面培养的降解菌点接到培养基中,每种菌做2个重 复。置于301培养箱中静置培养,并不断观察,待菌落 成型后染色。
 
染色:用0.2%刚果红染色30min,并依次用蒸馏 水和lmol/LNaCl彻底洗去染液,然后用5%醋酸液固 定颜色5min。观察透明圈大小并测量。
 
1.3.4纤维素酶特性的测定3-5二硝基水杨酸法(DNS 法)"酶液制备:将初筛选出的菌株分别接入1_无 菌水中,摇匀,再各汲取10ml加入复筛培养基中,在 28XM60r/min进行摇床培养。同时作木霉对照组。从 各菌株摇瓶培养基中分别取20ml发酵液,加入离心管 中,3000r/min离心10min。完毕后取上清液备用。纤维 素酶活力单位,采用国际单位(U),即在lmin内使底 物生成葡萄糖所需的酶量定义为lU?。
 
滤纸崩溃度测定:在试管中加入柠檬酸缓冲液 lml,酶液4ml及lcmx3cm滤纸1张,摇匀,使滤纸全 部浸入溶液中。然后将试管放入4(TC恒温水中保温 2h,取出后观察滤纸崩溃情况(将手指按住管口,把试 管颠倒1次),记录结果。
 
滤纸酶活力(FPA)测定%将滤纸定量(lcmx6cm) 卷成筒状放入试管中,加入1.0ml 0.05M pH4.8柠檬 酸一柠檬酸钠缓冲溶液和0.5ml稀释了 10倍的酶液, 在水浴锅中5(TC保温lh,采用DNS法测定还原糖的 生成量。
 
羧甲基纤维素酶活力(CMCA)测定A反应体系为 1.0ml 1%CMC-Na溶液,0.5ml稀释10倍酶液,水浴 锅50X:保温0.5h,采用DNS法测定还原糖生成量。 1.3.5碳源、氮源筛选碳源的筛选:氮源选择硫酸 氨,用葡萄糖、滤纸、麸皮代替澳门威利斯人88038盐。发 酵培养基仍为复筛培养基(其中蛋白胨视为提供生长 因子物质,而将硫酸氨看作氮源,澳门威利斯人88038盐 视为碳源),pH,培养温度和时间同复筛条件,做木霉 参考组。
 
氮源的筛选:碳源选择澳门威利斯人88038盐,用硝 酸铵、蛋白胨、硝酸钾代替硫酸氨。培养基依旧选用 复筛培养基,其余发酵条件同复筛情况,亦做木霉参 考组?
 
1.3.6最适pH值的筛选将待研究的菌株在其各自2.2初筛的最适碳源,氮源条件下(其余成分不变),将pH依次 调整为4、5、6、7、8、9六个梯度,于28*C恒温摇床培养 1周左右,测定其各自的CMC酶活力、FPA酶活力。 1.3.7培养时间对酶活力影响的测定在各自最适碳 源、氮源及pH值条件下,将待测各菌株及其混合菌群 于28°C下恒温摇床培养,以天为单位进行每日跟踪测 定CMC酶活力、FPA酶活力。记录数据后,绘制酶活 随天数变化曲线。
 
1.3.8纤维素分解菌形态的观察用压片法w制片后镜 检。
 
2结果与分析2.1富集、纯化经过富集、分离纯化后得到9株在分离培养基上 生长速度快,旺盛的菌株,分别命名为F-1?F-9。
 
根据刚果红透明圈直径大小与菌落直径的比值和 该酶活成正比的原理进行初筛,结果见(表1)?
 
考虑木霉参考样情况,结合各菌水解效果,共选出 6株真菌进入下一轮复筛,分别为F-l,F-2,F-3,F-5, F-6,F-8。
 
2.3复筛纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等 还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸(DNS) 还原,生成棕红色糖的量与反应液的颜色强度呈比例 关系,利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤 维素酶的活力。结果见(表2)。
 
综合考虑,选取F-1和F-6菌株进行后续研究。
 
2.4碳源、氮源对纤维素腌产董的影响改变不同碳氮源后所测得的酶活结果见(表3)。
 
表1刚果红培养基水解情况D(cm)F-1F-2F-3F-4F-5F-6F-7F-8F-9D1.605.400. 200.142. 258. 500.073.360. 53d0.533.240.090. 670.944. 720.071.200.24D/d3.01.72.30.212.41.81.02,82.2表2苗株滤纸崩渍度及酶活F-1F-2F-3F-5F-6F-8滤纸崩溃度+++-++-CMC 酶活(IU)58.057.0■-82.4-注:(1)崩溃度测定时,是以空白(即不加酶液样品)为对照进行比较得出(符号意义一:无变化边缘毛糙,膨胀++:有溃烂迹象,弯曲)* (2)酶液稀释倍数应按实际的酶活大小确定,本次试验通过对木霉预试验初步定为5倍。
 
表3不同碳源,氮*情况下F-l、F-?的产酶效果硝酸铵蛋白胨硝酸钾葡萄糖纤麸皮F-1F-6F-1 F-6F-1F-6F-1 F-6F-1F-6F-1 F-6CMC 酶活(IU)87.591.854.5 -84.263.6- -100.6144.7- -FPA_ 活(IU)-27.724.9 -24.030.0- --24.534.8 25.9硝酸铵蛋白胨 m酸钾葡萄糖 滤纸 鈇皮 围2不两碳源、氮湎情况下F-1和F-6的FPA酶活力比较由以上结果结合柱状图1和图2分析可知,纤 维素分解菌对不同碳源,氮源的利用率差异是非常 大的。碳源方面,F-1菌株在以滤纸为碳源时,CMC 酶活力最高,其余两者均较小。而在麸皮为碳源时, FPA酶活力最高,其余两者均较小,说明滤纸,麸皮 类物质对产纤维素酶具有良好的诱导作用。而葡萄 糖尽管能为菌株提供良好的营养物质,但是不利于 诱导产生纤维素酶。另外,对同一种碳源物质2种酶 活力不相符,例如F-1株在滤纸为碳源时,CMC酶 活很大,而FPA酶活却为零,这种情况有待进一步 探索。F*6菌株在滤纸培养时,酶活力最髙,且2类 酶活较统一。氮源方面,两者在氮源为硝酸铵时,均 表现出较髙CMC酶活力,其余氮源较低,说明加入 硝酸铵具有明显促进作用。同样,F-1菌株表现出2 种酶活力不相符的地方,如在硝酸铵为氮源时' CMC酶活很大,而FPA酶活却为零。所以,F-1和 F-6菌株的适宜碳源均为滤纸,两者适宜的氮源皆 为硝酸铵。
 
2.5最适pH值的筛选最适pH值的筛选结果见(表4)。
 
表4不同pH值下F-1和F-6的产酶效果pH 4pH 5PH6pH 7pH i3pH 9F-1F-6F-1F-6F-1F-6F-1F-6F-1F-6F-1 F-6FFA (IU)----25.4---26.4■-- -CMC(IU)41.844.262.161.672.986.566.7112.948.071.343.6 51.1图3 pH值对F-1和F-?酶促反应的彩响由于FPA酶活力太低,所以选择CMC酶活力作值时,曲线明显下降,且较快。F-6菌株在pH值4?5.5图?由图3可以看出,F-1菌株在pH值4?6.5呈现明呈现明显的上升趋势,当pH为6时有最大值,但再升显的上升趋势,当pH为7时有最大值,但再升髙pH髙pH曲线则呈现下降趋势。所以,对于两种菌株的较o^^so^o^o1 ^ 决毪 7e5^3 1*SI)S5馐 3H319.5植适pH值,其范围均在6?7之间。
 
2.6培养时间对产酶作用的影响培养时间对产酶作用的影响,结果见(表5、表6)。 对于F-1菌株,在最初的1?4d其酶活力均较低,这可 能是因为菌株被接种到液体培养基后有一段时间的适 应期,在此时期内,菌株产酶能力较弱,4d后酶活力上 升很快,7d左右可达最大值,当培养时间超过8d时, 菌株产酶能力迅速下降,这可能与底物浓度以及代谢 产物的抑制作用有关。对于F-6菌株,在最初的1?2d 其酶活力均较低,3d后酶活力上升很快,在7d左右可 达最大值,但当培养时间超过8d时,菌株产酶能力迅 速下降,跌落到最初水平,较之F-1曲线变化更剧烈。 对于F-1和F-6的混合菌群,在最初的1?2d内其酶 活力也是较低,3d后酶活力上升很快,在6d左右可达 最大值,可能是由于两者间酶系相互补充,才导致髙峰 期提前出现,但当培养时间超过7d时,菌株产酶能力表S不同培养时间下F-1的产酶效果Id2d3d4d5d6d7d8d9dlOdFPA 酶活(IU)---_-25.526.626.1-CMC 酶活(IU)0.041.646.250.360.376.5 ,96.289.054.748.5表6不同培养时间下F-6的产鸸效果Id2d3d4d5d6d7d8d9dlOdFPA_ 活(IU)两---25.426.627.026.2--CMC*活(1叻42.444.754.463.682.9111.6129.5120.666.751.8迅速下降,甚至低于两者单独存在时产酶曲线。
 
由图4可以看出,对于F-1菌株和F-6菌株两者 的最适产酶时间出现在第7天左右,而混合菌群在发 酵的第6天左右就出现了产酶髙峰期。
 
2.7菌株的鉴定F-1菌株。?菌落较大,质地略致密,棉絮状;外观干 生出;顶端生排列成帚状的间枝,分枝多次,顶层为小 梗;分生孢子串呈不分枝的链状,单个孢子为楠圆形。初 步鉴定为头抱霉属(cephalosporium cordd),见(图5) ?
 
? F-6菌株:菌落较大,质地疏松;外观干燥,呈现蛛网 状;表面粉粒状。菌丝有横隔膜,分生孢子梗从菌丝垂直 生出;分生孢子串呈不分枝的链状,孢子为椭圆形,初步3结论3.1该研究共分离纯化后得到9株纤维素分解菌进入 初筛,经过复筛获得2株最优良的菌株F-1和F*6菌 株进行后续研究。
 
3.2产酶条件研究发现,F-1和F-6菌株的适宜碳源均 为滤纸,适宜的氮源皆为硝酸铵,适宜pH值范围在 6?7之间,最适产酶时间出现在第7天左右?
 
3.3 2株菌通过形态观察初步鉴定为头孢霉属。
 
XML 地图 | Sitemap 地图