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纤维素降解菌的筛选及其降解特性的研究

发布日期:2015-05-25 11:09:18
纤维素降解
全世界每年大约形成1000?2000亿t植物有机物质,其中有一半是纤维素物质.我国每年 仅农业生产中形成的农作物残渣(稻草、秸秆等) 就约有7亿t,工业生产中还有数百万吨的纤维 素废弃物.这些废弃物即没有得到充分的利用,又污染环境,因此合理开发和科学利用这一丰厚 的天然资源是各国政府及科学家一直致力于且投 入大量资金及人力进行研究开发的重点领域.目 前对农作物秸秆的利用还未达到令人满意的水 平,其主要原因是缺乏对农作物秸秆这种天然纤 维素完全降解的高活性菌株.本文通过在自然环 境和秸秆降解物中大量采集和筛选后得出3种优 良菌株,并对其产酶特性进行初步研究,发现木霉 与青霉菌株混合培养后具有纤维素酶的高产协同 作用,为玉米秸秆中纤维素的有效降解提供一条 新的途径.
1材料与方法
1.1材料
大兴安岭地区土壤及腐木、玉米秸秆的降解 物,上海化学试剂企业生产的粘度为800 ~1 200 的澳门威利斯人88038(CMC -Na),玉米秸秆粉碎成 锯末状.
培养基:
初筛培养基:PDA培养基(马铃薯200 g,蔗 糖20 g,琼脂15 ~18 g,水1 000爪1、只值自然).
复筛培养基:CMC - Na 10 g,( NH4 )2SO4 4 g, KH2PO4 2 g,MgSO4 • 7H2O 0.5 g,蛋白胨 1 g,琼脂 16 g,蒸馏水 1000 ml.
发酵产酶培养基:CMC - Na 10 g,(NH4)2SO4 4 g, KH2PO4 2 g,MgS〇4 • 7氏0 0.5 g,蛋白胨 10 g,麦芽汁 10 ml,水 1 000 ml.
1.2方法
1.2.1纤维素分解菌的分离与纯化:将采集样品 按照常规的稀释分离法分离真菌并纯化,接种于 以玉米秸秆粉为主要基质的固体培养基中,在30 ~35 C条件下培养15 d观察菌的生长状况及培 养基的变色程度,选取菌株生长快、培养基变色程 度大的菌株作为纤维素分解菌,将该菌株接种于 以澳门威利斯人88038(CMC - Na)为唯一碳源的固 体培养基上进行复筛,根据菌丝的生长速度及 CMC - Na的液化程度,选出纤维素降解菌的优良 菌株.
1.2.2纤维素分解菌的单独与混合发酵培养:取 250 ml的锥形瓶,装入100 ml的培养基,并以体 积比为15%的接种量接种,使其活菌数达到1 X 109/m1,于30 °C、200 r/min的摇床震荡培养,每 隔24 h测量CMC酶活.
1.2.3!-1,葡萄糖酶液(CMC酶)制备与酶
活力测定方法:培养液经3 000 r/min离心10 min,上清液为粗酶液,取0. 1 ml上清液加入1.9 ml质量分数为1%的CMC - Na溶液,在50 C下 水解20 min,加入1. 5 ml DNS进行沸水浴10 min,定容至25 ml,在520 nm处比色.在上述条 件下产生1 "mol/min还原糖所需的酶量为个 酶活单位(u)[1].
1.2.4羧甲基纤维素酶相对活性测定:将纤维素 分解菌株在PDA培养基上单独或混合培养48 h 后,用1 cm2打孔器打孔转接在复筛培养基上生 长,每隔24 h测量其溶解圈的直径,取平均值计 算CMC酶相对活性A[2].
A =溶解圈的直径(cm)/菌体的培养时间(d) 1.2.5粗纤维利用率的测定:用质量分数为8% 的甲酸溶液处理降解剩余物,然后用定性滤纸过 滤,过滤时用蒸馏水分数次冲洗,将滤纸置于50 C下烘干至恒重[3].
1.2.6纤维素分解菌的单独或混合培养对玉米 秸秆降解的影响:取玉米秸秆粉100 g装入1 000 ml烧杯中,将菌种按1: 10接入秸秆粉中,于28 C观察其降解速度和表观变化,共观察30 d.
2结果
2.1纤维素分解菌的分离筛选与纯化
按照“培养!分离单菌落!纯化!初筛!复 筛”的方法,在大兴安岭地区的土壤、腐木及玉米 秸秆的降解物中分离到3种可对纤维素进行有效 降解的菌株.经初步鉴定,该3种菌株分属于木 霉属(Trichoderma. sp )、曲霉属(Aspergillus. sp )、青 霉属(Penicillium. sp).
2. 2纤维素分解菌的单独或混合培养对纤维素 酶活力的影响
将纤维素分解菌进行单独或混合培养,其处 理组合如下所示:A木霉、B 青霉、C
曲霉、D——木霉+青霉、E——木霉+曲霉、 F——木霉+青霉+曲霉.将6种处理组合分别 接入发酵产酶培养基中,每隔24 h测量CMC酶 活,结果如表1所示,72 h时CMC酶活的差异显 著性分析如表2所示,其CMC酶活的动态变化曲 线如图1所示.
表1纤维素降解菌株(群)在不同培养时间的纤维素酶活力
Table 1 Cellulase activity of strains at different culture time(u)
菌株/群t/ h
487296120144168216
A0.2132.2072. 4132. 4482. 4672. 5512. 222
B0.1830.1600. 2820. 1680. 8091. 4130. 886
C0.0981. 4541. 8482. 1312. 2302.1541.818
D1.6193. 1162. 8902. 9182. 9172. 9182. 788
E0. 9011. 7562. 1772. 2992. 3272. 3292. 253
F1. 2662. 0002. 3002. 3922. 5892. 6272. 100
表2不同处理组合在72h时纤维素酶活显著性分析 Table 2 Significance difference analysis between strains
 
after 72 h culturing
菌株/群72h时纤维素酶活/u显著性分析
5%1%
D3.116aA
A2. 207bB
F2. 000bcBC
E1. 756dCD
C1. 454dCD
B0. 160eE
注:SR测验对不同菌株(群)处理组合纤维素酶活在! =0.05,! = 0.01水平显著性分析的多重比较
由表2中可以得出在发酵培养72 h时D处 理的CMC酶活同其他处理比较为差异极显著,A 除了与F相比较为差异不显著,同其他处理比较 均为差异极显著.由图1所示可得出A、D处理 在发酵培养72 h后就出现产酶高峰,虽然在后期 A处理的CMC酶活有所上升,D处理的CMC酶 活有所下降,但仍高于其他处理组合且变化平稳. E、F处理在发酵培养96 h时出现产酶高峰,后期 同A处理相比较无明显差异,但要优于B、C处理 的产酶效果,B、C处理分别在发酵培养144、168 h 时才出现产酶高峰,但B处理的CMC酶活是最 低的.上述结果表明某些菌株混合培养的CMC 酶活要明显强于该菌株的单独培养,其中木霉同 青霉的混合培养就是一个明显的优势效应,它与 青霉单独培养的CMC酶活相比较可达到差异极 显著.木霉与曲霉,木霉与曲霉、青霉的混合培养 虽然同木霉相比差异较小,但比曲霉、青霉的单独 培养有较好的效果.
2.3纤维素分解菌单独或混合培养的CMC酶相
对活性比较
由表3中得出在以CMC为唯一碳源的筛选
平板上,D处理生长迅速,接种24 h后即可生长, 72 h后铺满平板,但与A相比液化CMC较慢;A、 E、F可使CMC迅速液化,同B、C相比生长速度 较快.E、F在培养48 h时的CMC酶相对活性略 低于A,但由图2中可以得出其后期差异不明显.
表3不同菌株(群)在CMC筛选平板上培养48 h后的
生长状况
Table 3 Development status of colony after 48 hours
菌株/群溶解圈直径平均值/cmA/ cm • d-1
A7.153. 58
B2. 401.20
C3.101. 55
D8. 254. 13
E6. 503. 25
F6.503. 25
图2不同处理在筛选培养基内菌圈的扩展面积 Fig. 2 Spread area of mycelium of different treatment
2. 4纤维素分解菌单独或混合培养对秸秆降解 的影响
表4表明所选菌株均可以不同程度地降解玉 米秸秆中的纤维素,但木霉与青霉的混合培养表 现出明显的协同效应,可以提高纤维素的降解量. 玉米秸秆中的纤维素被部分降解后其颜色由黄色 转为棕黑色和黑色,并产生较强的粘滑感,其中颜 色和粘滑感是有机质含量和降解后产糖的一个直 观标准,而且加入木霉与青霉混合菌培养的玉米 秸秆在经过30 d发酵后已降解至原来体积的 32% ,而单独加入曲霉和青霉的玉米秸秆则为原 来体积的45%左右,说明加入混合菌株可以加速 玉米秸秆的分解速度.
表4不同时间降解程度观察 Table 4 Degradation of straw at different time
菌株(群)粗纤维残余量/%体积减少量/%变色程度
A3660黑色
B5254棕黑色
C5155棕黑色
D3268黑色
3结论与讨论
(1)所筛选的3种菌株均能较大程度的降解 纤维素,说明这些菌株具有产生纤维素酶的特性, 或者具有合成这类胞外酶的基因;如将这类野生 型菌株进一步遗传改造,将会更大程度的加速纤 维素的降解,为秸秆等农业废弃物的有效开发利 用提供优势微生物菌种资源.
(2)目前国内外对分解纤维素能力较强的木 霉及其酶活性的研究较多,世界上所选育出来的 优良纤维素分解菌几乎都是木霉属菌株,而木霉 菌普遍缺乏一种限制因子——葡萄糖苷 酶[4’5],这可以使纤维二糖积聚,从而反馈抑制酶 活,降低酶解效率,影响纤维素水解为葡萄糖.近 年来,许多研究者在改进纤维素酶系组成方面做了 大量的工作;通过优化培养基的组成、改进菌种的 组成来提高葡萄糖苷酶的活性[6].现在有关 木霉与曲霉、青霉的混合菌培养降解纤维素以及它 们之间相互作用机理报道较少;本文筛选了 3株纤 维分解能力较强的菌株,并对木霉、曲霉、青霉的混 合培养的产酶及降解能力作了初步的探讨.
(3)自然状态下,纤维素的彻底降解是在微 生物体系中多种微生物长时间相互作用的结果, 这一过程仅靠一种微生物是无法实现的.这是由 于分解纤维素的酶是由多种组分组成的酶体系. 因此,在进行纤维素大分子降解的研究过程中要 考虑到微生物的产酶体系之间的协同效应.本实 验的结果表明木霉与青霉的混合培养具有最大的 协同效应,木霉同曲霉二者混合,木霉同曲霉、青 霉三者混合的培养效果与木霉单独培养无明显差 异,但比曲霉及青霉的单独培养效果显著,这也许 是因为曲霉的降解产物可以抑制木霉的产酶效 果,或与混合接种的时间、接种量有一定的关 系[7].
(4 )在实验的过程中发现培养时间的不同对 产酶的影响较大,木霉与青霉的混合培养在72 h 时达到产酶高峰,而后在近100 h内一直保持比 较平稳的变化,木霉同曲霉二者混合,木霉同曲 霉、青霉三者混合在96 h时达到产酶高峰,而后 略有上升或下降,这为菌种产酶时间的确定提供 了一定的理论依据,防止在实际生产中错过最佳 的产酶时机.
 
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