联系大家 / Contact

  • 澳门威利斯人88038
  • 联系人:王伟
  • 电 话:0533-8299008 13280657534
  • 手 机:13280657534
  • 传 真:请填写您的传真
  • 邮 箱:sddachina@163.com
  • 网 址:http://www.sdcmcchina.com/
  • 地 址:山东省淄博市周村区开发区工业园16号

分泌黄原胶酶菌株的红细胞凝集活性

发布日期:2015-06-08 15:43:41
凝集素是一类具有凝集细胞或沉降复合糖质作用的非免疫起源的蛋自质 或糖蛋白,广泛存在于动植物和微生物中。凝集素的发现距今己有〗00多年 的历史了,其最初的研究目的主要是为了阐明药用植物物质的毒性机理,以 及用于刺激产生抗体的免疫学研究。自二十世纪六十年代,凝集素研究发展 到了一个新的阶段,人们开始从分子水平更广泛、更深入的研究这类物质。 如今,凝集素作为抗肿瘤药物的研究己经发展到了一定阶段。它的作用是通 过免疫调节作用提高机体免疫力从而杀伤肿瘤细胞,对宿主细胞的毒副作用 很低,与传统的放化疗及化学合成药物相比,具有明显的优势。
微生物凝集素(microbial lectins,ML)最先发现的时间是1908年,Gugot 从大肠杆菌(Escherichiacoli)中找到了能凝集血细胞的凝集素。至今,已发现 了 208种以上的ML物质分析得知,常见的ML在微生物体的部位为细 胞表面。它们可以与细胞联系不密切,如特定的表面细胞器上,包括细菌菌 毛(fimbria)或纤毛(pm)。这些物质有时被称作为粘附素(adhesins),它们中许 多具凝血能力。
如同多数其他生物来源的凝集素一样,大多数ML的一个重要特性是对 某些/某种糖有结合性能,它具有可变换性和非共价性,其中有的结合能力的 特异/专一性很强D迄今发现与ML结合的糖及其衍生物之范围虽然有限,但 也达60种以上^分析认为,这些糖大多属于单糖、寡糖或者双糖之类,而以 甘露糖为多见,其次是半乳糖等。与同病原菌发生反应的动植物凝集素的结 合的糖种类相比,有一定差别⑵。
ML之所以如此引人注自,一是因为研究微生物本身所需。凝集素是微生 物自身进化发展之需。—些微生物,包括各类病原菌,需要与寄主发生各种
关系以发展自己。它们的凝集素可以是感染动物的毒力决定子,其中以大肠 杆菌对甘露糖和gaigal-专一的菌毛凝集素为突出例子。二是因为一些ML 有助于其产生菌选择识别寄主的表皮细胞,或者识别高等动物的白细胞《在 此,该凝集素起着细胞与细胞间相互作用中的识别分子(recognition molecules) 作用[3]。凝集素在此起识别活动的决定子(determinat)作用,如粘球菌 (Myxococcus)的细菌所显示的那样。这说明ML在介导各种正常和病理过程 中都起重要作用[4]。 试验材料:
1)血红细胞的制备
人的B型血样和小鼠由大连医科大学提供,动物血样取自大连市长兴农 贸市场。均取全血,用3.8 % (M/M)枸橼酸钠溶液抗凝,各抗凝血经2000 r/min 离心10 min除去血浆,加10倍体积的TBS溶液充分洗洚,然后经K!00r/min 离心3 min去上清液,重复4次,最后经2500 r/min离心3min,一部分配成 2% (V/V)的TBS-Ca2+红细胞悬浮液;另一部分配成不含Ca2+的2 % (V/V) 的TBS红细胞悬浮液。
将红细胞悬浮于lOmlTBS中,加入2mg胰蛋白酶,371:下消化1.5小时。 然后用TBS洗3次,在TBS中配成2%红细胞悬浮液。
2)菌悬液的制备
将菌种接种于黄原胶固体培养基上,于30°C的恒温培养箱中培养1-2天, 待新生菌体长出后,用 TBS-Ca2+溶液(TBS: 0.14 mol/L NaCl, 0.01 mol/L Tris-HCl,pH=7.4; TBS-Ca2+: TBS 中含 0.01 mol/L CaCl2, pH=7.4)洗下菌 落制成菌悬液。
黄原胶固体培养基组成:琼脂粉2%,蛋白胨0.1%,酵母浸出粉0.1%, 黄原胶0.3%,葡萄糖0.2 %,水97.3%。
S.1血凝活性的测定 试验方法:
活力测定在96孔U型微量血凝板中进行。先在每孔中加入25nLTBS-Ca2+ 溶液,再往第1孔中加入25队样品,混匀后,再从第1孔中汲取2SnL上述混合 液加入第2孔,以此类推作倍比稀释,最后在每孔中加入25nL2 % (V/V)的 TBS-Ca2+溶液红细胞悬浮液,振荡摇匀,在室温放置1?2小时后,肉眼观察。 如红细胞不发生凝集则在“U”型血凝板小孔内沉于孔底形成一界线清晰的红 色小点;如发生凝集,红细胞之间则形成一似网络扩散的红斑块。以有红细 胞凝集活力的最大稀释度为该凝集素样品的凝集活力(凝集效价),记为2n,以 TBS-Ca2+作空白对照。
结果与讨论;
XT-1I菌悬液对人的B型血及家兔、家鸡、家鸽、小鼠等4种动物红细 胞的凝集效价见表鞘氨醉单胞菌XT-11菌悬液对家兔的红细胞凝集作 用最强,凝集效价为26;对家鸡的凝集作用次之,为24;它不凝集小鼠和家 鸽的红细胞,同时也不凝集人的B型红细胞以及胰蛋白酶处理的人的B型红
细胞。
表5-]鞘氨醉单胞菌的凝集活性
Table 5-1 Hemagglutinationg activity of Sphingmonas sp.
红细胞类型凝集效价红细胞类型凝集效价
人B型0家鸽0
胰蛋白酶处
理后的人B型0家鸡24
 
5.2糖抑制试验
试验方法:
选取16种单糖、寡糖和糖蛋白,分别制成浓度为200 mmol/L的溶液。 往每一孔中加入25^iL糖溶液,然后加入25^1菌悬液,最后往各孔中加入 25pL的2%(V/V)的兔红细胞-TBS-Ca2+悬浮液,在室溫下静置2小时后,检 査凝集情况。
结果与讨论:
表5-2为16种糖对鞘氨醇单胞菌悬液凝集兔红细胞的影响。结果显示: 只有肝素可抑制菌悬液对兔血红细胞的凝集作用。至于其他糖类是否可以抑 制其对兔血红细胞的凝集作用,还有待于进一步的证明。
表5-2糖和糖蛋白对鞘氨酵单胞菌悬液血红细胞凝集活性的抑制作用 Table 5-2 Inhition of hemagglutination activity XT-11
抑制剂能否抑制抑制剂能否抑制
半乳糖-Heparin+
甘賻糖-D(-)Ribose-
N-乙酰半乳糖敢胺-Mucin-
N-乙酰葡萄糖酰胺琴Asialo-mucin-
岩藻糖-硫酸软骨素-
葡萄糖-P -Nitrophenyl-a-D-galactopyranose-
Metalose-D(+)Glucosamir hydrochloride-
Lactose-Thyroglobulin-
53热稳定性 试验方法:
将菌悬液样品分别在4°C冰箱及温度为20BC, 30DC, 37°C,4(TC,5CTC,
60 °C的恒温水浴中处理30min,测定各样品的凝集活力。
结果与讨论:
菌悬液XT-11血凝集的热稳定性实验结果见图5-〗。菌悬液血凝集活性具 有一定的热稳定性。在4‘C时效价最髙为26,随着温度的降低凝血活性逐渐下 降,当温度到达6CTC时丧失活性。这表明它的血凝集活性是热不稳定的。
pH
图5,1菌悬液血凝活性温度依赖性
图5-2菌悬液血凝活性pH依赖性
Figure 5-1
Figure 5-2 Influence of pH on the agglutinative activity
5.4 PH影响的测定
试验方法:
在测定pH对菌悬液凝集活性影响时,使用下列缓冲液:pH为4~6的 Hac-NaAc缓冲液;pH为7?9的Tris-HCl缓冲液;pH为10-11的Gly-NaOH缓冲 液。将血清样品的pH值调至40, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9,0和10.0,在4°C密封 的容器中放置2小时,然后将各溶液的pH值调至7.4,测定各样品的凝集活力。 结果与讨论:
XT-11菌悬液在不同pH值条件下的凝集反应实验表明,菌悬液中的凝集素 对pH值的变化比较敏感(图5-2).由于在pH值低于5或高于10时兔红细胞发生
全部或部分溶血现象,影响实验的结果,因此没有统计在结果中,但从图2 也可以看出鞘氨醇单胞菌的凝集活性具有一定的pH值稳定性。在pH为6.0? 10.0范围内较稳定。
S.5Ca2+对血凝活力的影晌
试验方法:
取菌悬液25pL,在96孔U型板中与等量的TBS溶液经系列倍比稀释后, 每孔分别加入25juL的10, 20, 40 mmoi/L的EDTA溶液,用2% (V/V)的兔 红细胞-TBS悬浮液检测其活性;若活性降低或消失,则加入0.05mol/L TBS-Ca2+溶液,观察其活性的变化。对照组用TBS-Ca2+溶液作倍比稀释,用 2°/〇 (V/V)的兔红细胞-TBS-Ca2+悬浮液检测其活性。
结果与讨论:
金属离子螯合剂EDTA对XT-11菌悬液的凝集活力没有抑制作用。将XT-11 菌悬液在40 mmol/LEDTA溶液中透析过夜后,在不含Ca2+的TBS缓冲液中透 析,然后测定其血凝活性。同时在分别加入10, 20, 30, 40 rmnol/LCa2+的 TBS缓冲液中测定其血凝活性。发现它的血凝活性没有任何变化。这表明 XT-11菌悬液的血凝活性不受EDTA的影响,不依赖于Ca2'
S.6鞘氨醇单胞菌XT_11的粗提蛋白对血凝活性的影响 试验方法:
将鞘氨醇单胞菌XT-11在KS-250型超声波细胞粉碎机(宁波科生仪器厂, 中国)上粉碎20 min,用含0.15 mol/LNaCl的TBS溶液在4°C抽提过夜。 5〇OOr/miii离心2〇1^11取上清液。加入硫酸铵到7〇%浓度(>5〇〇〇^0士1离心2〇1^11, 收集沉淀,溶于含0.15mol/LNaCl的TBS溶液中,在此缓冲液中透析除去硫 酸铵《测定其血凝活性。
结果与讨论:
鞘氨醉单胞菌XT-U的蛋白样物质经硫酸铵盐析、TBS溶解蛋白沉淀、透
析脱盐后,获得的粗提蛋白溶液,发现其仍然具有血凝活性。
5.7本章小结
鞘氨醇单胞菌XT-1I悬液能凝集2种血红细胞。菌悬液对兔红细胞的凝集可以被肝素所抑制。其凝集活性不依赖于Ca2+;在pH为6.0?10.0范围内较稳定;它的凝集活性在6CTC时完全丧失。以上结果表明:该菌含有具有红细胞
凝集活性的物质。
 
XML 地图 | Sitemap 地图