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黄原胶降解菌菌株产酶和降解能力的研究

发布日期:2015-06-12 17:30:42
黄原胶是经发酵X程生产的一种用途广泛的 微生物胞外多糖。在食品、石油、医药、日用化工 等十几个领域有着极其广泛的应用降解菌。黄原胶超 常的稳定性极大地扩展了其应用范围,但在应用 过程中其黏度过高也带来一些问题,如在提高采 油率的同时也增加后继工艺如原料运输及产品的 成本[2]。同时黄原胶的降解产物寡糖还具有抗病 毒、抑菌、诱导植物抗性、提高免疫力等功能,可进 —步开发利用。因此,找到能高效降解黄原胶的 微生物菌株有着生产应用的潜在价值[3]。
1材料与方法
1.1菌种来源
从土壤和水中分离筛选出1株具较强降解能 力的黄原胶降解菌,该菌能够以黄原胶为唯一碳 源进行生长,并具有黄原胶降解酶活性。
1.2药品
工业级黄原胶、甘露糖、魔芋粉、葡萄糖、柠檬 酸、酒石酸钾钠、3,5-二硝基水杨酸、苯酚、二甲基 氨基苯甲酸、溴百里酚蓝、溴甲酚紫、琼脂粉、结 晶紫、草酸铵、Na2 HP04、K2 HPC^、KH2 P04、 NH4 Cl、MnS()4、ZnS04、MgSO“ CuS04、FeS()4、 CaCl2、NaCl、Na2S04、NaOH,其它化学试剂均为 分析纯 1.3培养基
1.3.1选择性培养基(g^L1) 黄原胶5g, NH4C1 6 g,Na2HPO,5 g,NaH2P04 5 g„
1.3.2种子液培养基(g.L1〉 葡萄糖5g, NH4C1 6 g,Na2HP()45 g,NaH2P04 5 g,微量元 素液4 mL。
发酵培养基(g-L1)黄原胶5g,NH4Cl 6 g,K2HF04 5 g,KH2P04 5 g,微量元素液 4 mL。
1.3.4微量元素液(mg*L-1) ZnS04 0. 1 mg, CuS04 0.1 mg,MnS04 0.1 mg»MgSO40.1 m^510 1.4仪器与设备
752紫外可见光分光光度计(南京第四分析 仪器有限企业);CF 16RX高速冷冻离心机(日本 HITACHI企业);ZNN-D6A型六速旋转黏度 仪(青岛海通达专用仪器厂h 1.5方法
1.5.1菌种筛选将所取土样悬浮于灭菌后的 生理盐水中,进行梯度稀释,常规方法涂布黄原胶 平板,3CTC培养箱培养24 h。挑单个菌落于选择 性培养基中划线,经过培养,再从中挑选单个菌落 接种于新的选择性培养基中,反复操作至菌种完 全纯化,然后接种于斜面培养基中4SC保存w。 1.5.2粗酶液制备将菌种接种到含100 mL 种子液培养基的250 mL三角瓶中,3(TC 160 r«min_1 振荡培养,5 000 r*min_l 离心 10 min 收集菌体。用无菌生理盐水洗涤菌体3次,调整 细胞浓度1〇8个•mL'制成种子液。
在500 mL三角瓶中装200 mL发酵培养基, 按接种量1%接人种子液,3(TC 160 i-min1振荡 培养24 h 5 000 r*min_l离心10 min,上清液即粗 酶液。
1.5.3醉活測定还原糖标准曲线的绘制方法 为:分别在水解管中加入〇. 5 g*I^的Glucose标 准溶液〇、5、10、30和40 pL,用双蒸水补至 200 PL,向其中各加150 jiL PAHBAH溶液, 600 NaOH(5%)溶液,混匀,12(TC 加热 15 min,用酶标仪测定OD<1)5w。
甘露聚糖酶活力测定方法:将一定量粗酶液 与0. 25%黄原胶水溶液混合,30°C水浴反应
45 min,马上取200 ML反应液加到750 fxL 5% PAHBAH和5%Na()H的混合液中,12(TC加热 15 min,用酶标仪测定OQ。.,。
黄原胶降解酶的活力定义为每分钟催化形成 相当于1 pmol葡萄糖的还原末端所需的酶量为 一个酶活力单位[9]。
1.5.4不同氮源对菌种产酶的影响用不同氮 源(含氮量终浓度为〇. 2%)代替发酵培养基中的 NH4C1,研究各氮源如蛋白胨、胰蛋白胨、甘氨酸、 尿素、硝酸铵、磷酸氢二铵和氯化铵对产酶的影 响,取对数生长期的菌种接种于上述培养 基中[1°]。
1.5.5不同磷源对菌种产酶的影响分别以 NaH2P04,卩-甘油磷酸钠或者ATP(含磷量的终 浓度为0.22%)作为唯一磷源,其它元素按发酵 培养液配方,取对数生长期的菌种接种于上述培 养基中[11]。
1.5.6酶学性质JP3最适pH及其稳定性:在 pH 4. 0?9. 0的缓冲液(pH 4. 0?6. 5为 0.05 mol.L1柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液;pH 7.0? 8.0为0.05 mo卜L1 \3只?04屮3私?04缓冲液; pH 9. 0为0. 05 mol. L1的甘氨酸-NaOH缓冲 液)中,测定酶活力[12]。
粗酶液与不同pH的缓冲液(pH 9. 0?10. 5 为0.05 mobL1碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)于30'C 保温6 h后,测定酶活力。
最适温度和温度稳定性:将反应体系于不同 温度测定酶活力,研究酶的最适温度。将酶液在 不同温度下保温30 min后测定酶活力,分析酶的 温度稳定性。
金属离子对酶活的影响:在不同金属离 子(Cu2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Na+、Ca2+ 等)存在 时测定酶活(最适温度,最适pH),以未添加金属 离子的酶活作为空白对照(100%),除Na+为 150 mmobU外,其余的金属离子浓度皆为IX 10'3mol»L'1[13] „
米氏常数:以不同浓度的黄原胶作底物,测定 酶活力,计算酶反应的初速度。每个样品做3次 平行测定,通过反应初速度和底物浓度的倒数作 图,得到双倒数图。根据直线在X轴和Y轴的截 距,利用米氏方程可得米氏常数Km和最大反应 速度 Vmax[14]。..
底物浓度对酶活性的影响:底物浓度分别为 0.5%、1.0%、1.5%时发酵液菌体生长随时间的 变化规律,摇瓶装量为30 mL,初始pH为7. 0,接 种量为1. 0%,摇速为200 r.min-1。
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1.5.7降黏率采用PAHBAH法测定黏度。 按比例接菌种于300 mL无菌液体培养基,调节 pH后,测量初始表观黏度V。,记录测量温度T。, 放置恒温摇床培养一段时间后取出,水浴加热或 自然冷却,使溶液温度恢复为r。,迅速测量表观 黏度V,,继续放置摇床培养观察。用旋转黏度仪 测量黏度,则降黏率为:W/% = (V。一 W)/ V〇 X 100115]«,
2结果与分析
2.1菌种的采集和分离及筛选
经对反复筛选和培养过程中培养液粘度下降 程度和速度的比较,选出1株对黄原胶降解能力 最强的菌落,命名为X08a。菌株X08a为细菌,在 生长过程中呈杆状,老龄菌为球形,菌体形态不规 则;不形成孢子,革兰氏染色阳性[16]。
2.2菌株X08a黄原胶酶酶活测定
酶标仪测定〇?40 fxg葡萄糖绘制标准曲 线(见图1),得直线方程:V=0.022 7z+0.074 6。
图1还原糖标准曲线
由图2可知,随培养时间的延长,培养基的粘 度迅速下降,黄原胶降解酶活力逐渐上升,二者几 乎同步变化,说明X08a菌生长过程中分泌胞外 降解酶将黄原胶降解,提供生长所需能量。
由图3结果可知,以NH4C1作为氮源时,菌 体酶活力最高。氯化铵来源广,价格低,是理想
氮源。
250
图3不同氮源对X08a黄原胶酶产嗨的影响
2.4 不同磷源对菌株X08a黄原胶酶产酶的 彩响
图4表明,以Na2HP04、(3-甘油磷酸钠或者 ATP作唯一磷源时,甘露聚糖酶活性都随磷源浓 度的增加而逐渐增高。Na2HP04更有利于菌株 X08a生长和产酶。
2.5X08a黄原胶酶酿学性质的测定
图5表明,该酶最适pH范围为5?6。菌株 X08a产酶期间以1 h为时间间隔,分别在不同 pH条件下测其酶活,可看出3条曲线间距不大, 即不同时间点的黄原胶酶在相同pH条件下的酶 活差别不大,说明在相同pH条件下这种酶产生 的时间长短对其酶活影响较小。
图6 X08a黄原胶酶的最适温度 对酶活几乎无影响。说明该酶含有金属离子,该 金属离子可能是酶的直接活性中心,也可能是作
为辅基起到辅助性作用(见图7)。
100
迄80 瀘60 « 40 20
图7金属离子对X08a黄原胶酶酶活的影响
根据计算,米氏常数Km=0.24最
大反应速度Vmax=68pmo卜(min*g)_l。表明这 种酶的反应速率与酶的浓度成正比(见图8)。 
 
°3456789 it)
pH
ffl5 X08a黄原胶酶的最适pH
图6表明,这种酶最适温度为30?40°C。菌 株X08a产酶期间以1 h为时间间隔,分别在不同 温度下测其酶活,3条曲线的数值差別较大,即在 不同时间点的黄原胶酶在相同温度下的酶活差别 较大,说明在相同温度下这种酶产生的时间长短 对其酶活有较大影响。I‘
金属离子Na+、Ca2+和EDTA均显著降低酶 活。Mg2'Zn2+对酶活有抑制作用,Cu2+、Mn2+
表1表明,底物浓度在1%时,黄原胶酶活性 最高。
表1底物浓度对产醮的彩响
培养时间/h1.50%底物浓度
2.6降黏率
由图9可知.随时间变化,黄原胶溶液的黏度 逐渐下降,第1天黏度下降32%,第2天变化较
小,第3天有明显下降,之后黏度缓慢下降。黄成 栋等研究表明,黄原胶分子的降解有主链降解和 侧链降解2个过程。主链降解对黄原胶的黏度变 化影响较侧链大,但侧链的存在阻碍了主链的 降解。
图9黄原胶溶液降黏率的变化情况
3结论与讨论
'该试验分离出了1株产黄原胶降解酶的细菌 菌株X08a,单位时间内对黄原胶有较高降粘率。 研究发现细菌X08a分泌的黄原胶降解酶对温度 敏感性较高,对pH要求则相对宽松;通过金属离 子对酶活性影响,推测有二价的主族金属离子作 为辅助因子对酶的活性起作用;通过酶反应初速 度(V)与底物浓度(S)之间的关系可知这种酶的 底物专一性较强。而由该酶降解黄原胶所得到的 寡糖的结构、组成以及可能拥有的生物活性,则有 待进一步研究。
 
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